| 研究課題/領域番号 |
22H02581
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
徳永 万喜洋 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (00192659)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 生物物理 / バイオイメージング / 細胞情報・動態 / 生体分子計測 / 超解像顕微鏡 / １分子イメージング軌跡追跡 / 移動部分軌跡解析法 / HILO照明 |
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| 研究実績の概要 |
「分子を観て、機能を知る」ために、申請者らが開発した超解像１分子多種同時イメージング法を統合的に用い、動態・ナノ局在・機能“場”同時、かつ、多種分子同時の分子イメージング、多種類データ取得、多様な時空間定量データ群を統合的に相関解析し、分子機能を解明する『動態・ナノ局在・機能相関学』を創出することを目的として、次を行った。１．超解像１分子多種同時イメージング顕微鏡の改良。『動態・ナノ局在・機能相関学』創出に必要な性能を満たすべく、高精度高速超解像イメージングと１分子蛍光イメージングを生細胞で同時観察できる４色までの多色対応蛍光顕微鏡として、現有設備を改良した。２．蛍光標識分子の調製。超解像用にはphoto- switchable fluorescent proteins、１分子イメージング用にはGFP/SNAP-tag蛍光色素などを、目的タンパク質遺伝子(RNAポリメラーゼII、転写制御分子等)に導入した。３．１分子イメージング動態解析。申請者らの開発した移動部分軌跡解析法を用い、１分子イメージング軌跡追跡により、分子動態を時間・空間の関数として定量計測した(Sci Rep, 2017)。部分軌跡を全軌跡中で１点ずつずらしてゆくことで経時変化を追い、動態・分子間相互作用情報を時間・空間の関数として定量した。４．超解像解析。局在化方式(PALM/STORM) 超解像画像を、20～30 nm程度以上の高精度にてナノ局在解析した。５．領域マーカー対応。超解像と１分子軌跡の重ね合わせ画像（2～3色）に、1～2色の領域マーカー画像を重ね合わせ、分子局在・分子動態・相互作用を、注目領域と関連付けながら、時間・空間の関数として定量した。６．cluster解析を行い、以上で得られたデータ郡を、相互に関連付けながら、一連の解析フローとして相関解析するプログラムシステムを構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
分子機能を解明する『動態・ナノ局在・機能相関学』を創出するため、超解像１分子多種同時イメージング法を統合的に用い、動態・ナノ局在・機能“場”同時、かつ、多種分子同時分子イメージング、多種多様な時空間定量データ群を統合的に相関解析し、「分子を観て、機能を知る」ことを可能にすべく、本年度の研究計画を推進した。「１．超解像１分子多種同時イメージング顕微鏡の改良」においては、生細胞で４色までの多色対応蛍光顕微鏡として、特に蛍光照明を改善する方法を導入した。「２．蛍光標識分子の調製」においては、RNAポリメラーゼIIの転写過程ごとの動態・相互作用を区別して観察できるように試料調製を工夫した。「３．１分子イメージングによる動態解析」においては、申請者らの開発した、分子動態を時間・空間の関数として定量計測する方法である移動部分軌跡解析法を用い、時間空間の関数としての多種類定量データを取得する解析方法を導入した。「４．超解像解析」においては、局在化方式(PALM/STORM) 超解像のナノ局在解析に、種々解析法を導入・考案し、多様な定量データ郡を取得する方法を導入した。「５．領域マーカー対応」においては、RNAポリメラーゼの転写状態を識別する領域（“場”）マーカーに対応した。「６．多種多様データの統合的相関解析」においては、多種定量データ取得を行い、以上で得られたデータ郡を、相互に関連付けながら、一連の解析フローとして相関解析するプログラムシステムを構築できた。いずれも、おおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．超解像１分子多種同時イメージング顕微鏡の改良。『動態・ナノ局在・機能相関学』創出に必要な性能を満たすべく、高精度高速超解像イメージングと１分子蛍光イメージングを生細胞同時観察できる４色の多色対応蛍光顕微鏡の改良を進める。特に、TIRF（全反射照明法）/HILO（薄層斜光）照明法の新規改良法を開発する。２．蛍光標識分子の調製。既に調整したものに加え、遺伝子の転写開始・伸長を可視化するため、リン酸化等の修飾を受けたクロマチンに特異的に結合する抗体由来の遺伝子コード型生細胞蛍光プローブであるmintbody（東工大 木村研究室開発）を導入する。３．１分子イメージング動態解析。申請者らの開発した１分子移動部分軌跡解析法を用い、分子動態を時間・空間の関数として定量計測する(Sci Rep, 2017)。動態・分子間相互作用に関する多種類情報を時間・空間の関数として定量するソフトウェアシステムを開発する。４．超解像解析。局在化方式超解像画像の高精度ナノ局在解析と、1分子イメージング軌跡追跡の同様解析とを、関連付けながら行うソフトウェアシステムを開発する。５．領域マーカー対応。超解像と１分子軌跡の重ね合わせ画像に、1～2色の領域マーカー画像を重ね合わせ、分子局在・動態・相互作用を、注目領域と関連付け、時間・空間の関数として定量するソフトウェアシステムを開発する。６．多種定量データ取得。３～５の解析結果を統合し、多種類のデータを時間・空間の関数として定量する方法を導入する。７．cluster解析を加え、得られるデータ群を、相互に関連付け、一連の解析フローとして相関解析するプログラムシステムを改良する。８．以上により、『動態・ナノ局在・機能相関学』創出に向け、データ群取得解析システムを構築する。［研究協力者］東京工業大学・生命理工学院 伊藤由馬 クロマチン動態１分子超解像観察と解析
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