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2023 年度 実績報告書

再構成型翻訳・フォールディング連動システムの開発と関連する病気の解析

研究課題

研究課題/領域番号 22H02612
配分区分補助金
研究機関兵庫県立大学

研究代表者

今高 寛晃  兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (50201942)

研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2026-03-31
キーワード翻訳 / 再構成 / タンパク質合成 / 小胞体 / フォールデイング / シャペロン / リポソーム / CFTR
研究実績の概要

SRP再構成 について: HeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムで各サブユニット(SRP9-HA, SRP14-HA, SRP19-HA, SRP54-HA, SRP68-FLAG, SRP72-HA)を発現し、T7 RNPを用いて合成したSRP RNAを混ぜインキュベートすることでSRP複合体を形成させ、SRP68に付加させたFLAG配列に対する抗体を用いて精製した。HA抗体によるwestern blotting を行うと他のすべてのsubunitが含まれていることが確認できた。
SR/Sec61のリポソームへの組み込みについて:SRPリセプター (SRa-FLAG, SRb-FLAG), Sec61複合体 (Sec61a-FLAG, Sec61b, Sec61g) をHeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムで発現し、界面活性剤を添加した状態でFLAGレジンに架け、界面活性剤存在下で溶出した。そこに、リポソームを加えインキュベートした。透析により界面活性剤を抜くことで、タンパク成分の組み込みを促した。蛍光基の付いたFLAG抗体を用いて蛍光顕微鏡で観察すると、リポソームの膜が蛍光を発していた。つまりSR/Sec61がリポソームへ組み込みこまれていることを示唆している。
Signal peptidase発現について:Signal peptidaseの構成サブユニット(a, c, b,g)ををHeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムで発現した。同時にSP (signal peptide)-EGFP HAも発現し、SP配列が切断されるかどうか調べたが、切断されていなかった。
CFTR発現について:CFTR全長(1480aa)をPCR templateを用いて、HeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムと再構成型翻訳システムを用いて発現することに成功した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2023年度の交付申請で掲げた課題であった「SRP再構成」「SR/Sec61のリポソームへの組み込み」そして「CFTRの試験管内発現」のいずれも成功している。したがって順調にプロジェクトを進めていると考える。

今後の研究の推進方策

SRPリセプター (SRa, SRb), Sec61複合体 (Sec61a, Sec61b, Sec61g) が組み込まれたリポソームへ、Signalペプチダーゼ複合体(Sec61a, Sec61c, Sec61b, Sec61g)を組み込んでいく。組み込みは、界面活性剤と脂質成分そしてタンパク成分を混合し、界面活性剤を透析で除去することにより行う。様々な界面活性剤や脂質成分を試すことにより組み込みを成功させる。そして、再構成翻訳系にSRPとSR-Sec61- Signalペプチダーゼが組み込まれたリポソームを添加し、SP (signal peptide)-EGFP HAを発現させる。もし、SP配列が切断された場合はリポソーム内が蛍光を発する。同時にHAによるwestern blotも行う。
そして、Sec61以外のER成分に関する因子群:Sec62, Sec63, ER関連シャペロン(ERjip, ERj2, CANX, CALR, Erp57, PDIA3)、TRAP複合体(subunit1,2,3,4)、EMC複合体(EMC subunit1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10)、PAT複合体(CCDC47, WDR83OS)、BOS複合体(NCLN, TMEM147, NOMO1)、GEL複合体(C20orf24, TMCO1)などをリポソームに組み込むため、これらの発現系を整える。また、co-translational糖鎖付加を試験管内で再構成するために、糖鎖付加酵素複合体(SSTT3a, DC2, KCP2, OST4, TMEM258, RPN2, OST48, DAD1)をクローニングしていく。
更に、CFTRをリポソーム上で発現し、塩素イオンチャネルとして機能するかどうかを検討していく。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (6件)

  • [雑誌論文] High-throughput screening for a SARS-CoV-2 frameshifting inhibitor using a cell-free protein synthesis system2024

    • 著者名/発表者名
      Machida Kodai、Tanaka Rin、Miki Seraya、Noseda Shotaro、Yuasa-Sunagawa Mayumi、Imataka Hiroaki
    • 雑誌名

      BioTechniques

      巻: 76 ページ: 161~168

    • DOI

      10.2144/btn-2023-0102

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Reconstitution of C9orf72 GGGGCC repeat-associated non-AUG translation with purified human translation factors2023

    • 著者名/発表者名
      Ito Hayato、Machida Kodai、Hasumi Mayuka、Ueyama Morio、Nagai Yoshitaka、Imataka Hiroaki、Taguchi Hideki
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 13 ページ: 22826

    • DOI

      10.1038/s41598-023-50188-z

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Extracellular aaRSs drive autoimmune and inflammatory responses in rheumatoid arthritis via the release of cytokines and PAD42023

    • 著者名/発表者名
      Kimura A、Takagi T、Thamamongood T、Sakamoto S、Ito Ti、Seki I、Okamoto M、Aono H、Serada S、Naka T、Imataka Hi、Miyake K、Ueda T、Miyanokoshi M、Wakasugi K、Iwamoto N、Ohmagari N、Iguchi T、Nitta T、Takayanagi H、Yamashita H、Kaneko H、Tsuchiya H、Fujio K、Handa H、Suzuki H
    • 雑誌名

      Annals of the Rheumatic Diseases

      巻: 82 ページ: 1153~1161

    • DOI

      10.1136/ard-2023-224055

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] ER連動型ヒト因子由来・再構成型翻訳システムの開発2024

    • 著者名/発表者名
      砂川真弓, 金光風香, 豊田紗綾, 岡林瑞希, 村井優哉, 井上翼, 町田幸大, 今高寛晃
    • 学会等名
      第18 回 無細胞生命科学研究会
  • [学会発表] CAG リピート由来フレームシフトの試験管内解析2024

    • 著者名/発表者名
      町田幸大, 北尻寛大, 砂川真弓, 今高寛晃
    • 学会等名
      第18 回 無細胞生命科学研究会
  • [学会発表] C9orf72-GGGGCC リピートで生じるRepeat Associated Non-AUG(RAN)翻訳のヒト翻訳因子による再構成型翻訳系を用いた分子機構解析  伊藤隼人, 町田幸大, 蓮見眞由香, 上山盛夫, 永井義隆,2024

    • 著者名/発表者名
      伊藤隼人, 町田幸大, 蓮見眞由香, 上山盛夫, 永井義隆, 今高寛晃, 田口英樹
    • 学会等名
      第18 回 無細胞生命科学研究会
  • [学会発表] CAGリピート由来の翻訳にポリアミンが与える影響の解明 Elucidation of the effects of polyamines on CA2023

    • 著者名/発表者名
      町田幸大、北尻寛太、今高寛晃
    • 学会等名
      第46回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] ER連動型ヒト因子由来・再構成型翻訳システムの開発2023

    • 著者名/発表者名
      砂川真弓, 井上翼, 岡林瑞希, 金光風香, 豊田紗綾, 町田幸大, 今高寛晃
    • 学会等名
      第46回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] ポリアミンによるRAN翻訳の誘導効果の解析2023

    • 著者名/発表者名
      小黒明広,植村武史,町田幸大,田島彩沙,河合剛太,今高寛晃
    • 学会等名
      第46回日本分子生物学会年会

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公開日: 2024-12-25  

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