難治性白血病の内在性レトロウイルス活性化機序に基づく新規バイオマーカー開発

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22H02974
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 田部 陽子 順天堂大学, 大学院医学研究科, 教授 (70306968)
• 研究分担者: 藍 智彦 順天堂大学, 医学部, 教授 (00570128) ; 渡邉 達郎 佐賀大学, 医学部, 特任教授 (20595714) ; 岡崎 康司 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (80280733)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2027-03-31
• キーワード: 急性骨髄性白血病 / DNAメチル化 / BCL-2 / 内在性レトロウイルス / シングルセル解析

研究実績の概要

本研究では、難治性急性骨髄性白血病AMLにおけるDNMT阻害剤の抗腫瘍作用機序と耐性獲得の分子機構を明らかにし、「BCL2とDNMT同時阻害」治療の効果識別マーカー（＝耐性因子）を探索する。初年度の研究概要として、まず、BCL2阻害剤Venetoclax(VEN)とDNMT阻害剤Decitabine（DEC）による「BCL2とDNMT同時阻害（VEN-DEC）」臨床試験参加症例から採取した臨床検体を用いて、治療奏効群と非奏効群および治療前後のAML細胞内のエピゲノム変化を明らかにし、治療感受性/耐性責任遺伝子候補を抽出することを目的としてDNAメチル化アレイ解析を実施した。その後、DNAメチル化アレイ解析結果をすでに得られているRNA-seq解析結果と統合し、治療奏効群と非奏効群の遺伝子発現/メチル化状態について、未治療症例、再発/難治性症例に分けて解析し、耐性責任候補遺伝子の絞り込みを行った。また、AMLにおけるDNMT阻害剤の抗腫瘍作用機序について、AML患者検体においてヒト遺伝子内に組み込まれた内在性レトロウイルス（ERV）に注目して検証実験を行った。すなわち、①VEN-DEC臨床試験に参加したAML臨床検体において認められた治療後のERV遺伝子発現亢進が、AML細胞株において再現されること、②ERV遺伝子再活性化は、VENではなく、DECによって誘導されること、③DNMT阻害剤（DEC）によって活性化されたERVがインターフェロン誘導遺伝子（ISG）発現を誘導すること、を確認し、ERV double strand RNAによるISG発現亢進（＝INF誘導）のシグナル伝達経路について検討した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

VEN-DEC臨床試験参加患者検体を用いたRNA-seq解析およびDNAメチル化アレイ解析データを用いて治療奏効群と非奏効群間の治療前の遺伝子発現およびDNAメチル化レベルの差異を検出し、さらに非奏効群においては、治療前後の遺伝子発現変化とDNAメチル化の関連性について統合的解析を進めた。その結果、非奏効群において奏効群と比較して治療前のDNAメチル化レベルの低下を伴って発現亢進を示す複数の遺伝子が抽出された。さらに、これらの遺伝子の一部は、VEN/DEC治療後にDNAメチル化レベル低下と遺伝子発現亢進を示した。これらの遺伝子には、ISGや代謝関連遺伝子が含まれた。これらのVEN/DEC耐性責任候補遺伝子の発現とDNAメチル化状態の変化を、AML細胞株を用いてqRT-PCRとバイサルファイト・パイロシーケンス法で検証した結果、抽出した候補遺伝子のうち、複数の遺伝子発現がDNAメチル化酵素阻害剤の直接制御下にあることを確認した。また、AML細胞株を用いたoverexpression実験を行い、代謝関連候補遺伝子のoverexpression細胞において、VEN-DEC治療によるapoptosis誘導効果が減弱することを確認した。さらに、AML細胞株を用いてAML細胞内の内在性レトロウイルス（ERV）がDNMT阻害剤によって活性化され、ERV double strand RNAがインターフェロン誘導遺伝子（ISG）の発現を誘導することを示した。内在性ERV遺伝子実験に使用するため研究協力者より提供された凍結臨床検体の一部の保存状態が不良で、新たに臨床検体の追加が必要となり、検体情報の確認に時間を要することが判明した。このため内在性ERV遺伝子の活性化の確認実験及び内在性ERV遺伝子の下流シグナルの検証実験について、追加検体分の実験条件設定作業を延長して実施する必要が生じた。

今後の研究の推進方策

AML細胞内の内在性レトロウイルス（ERV）がDNMT阻害剤によって活性化され、ERV double strand RNAがインターフェロン誘導遺伝子（ISG）の発現を誘導する際のシグナル経路について、IRF3を介した経路の活性化とTBK1の役割をTBK1 knock down およびTBK1阻害剤を用いて検証する。これによってDNMT阻害剤によるERV活性化とINF産生につながる下流シグナル経路を示す。また、single cell RNA-seqによって複数のAML細胞クラスターの存在を明らかにし、leukemia stem cell (LSC)クラスター内のAML細胞の遺伝子発現の特徴を抽出することによってVEN-DEC治療耐性に係るLSCの遺伝子発現パターンとLSCにおける耐性責任遺伝子をシングルセルレベルで明らかにする。さらに、他のAML細胞クラスターとLSCクラスターにおいて治療耐性細胞で発現が亢進する遺伝子が一致するか、不一致であるかを調べ、AML細胞に共通して作用する治療耐性関連遺伝子および形質を検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Resistance to energy metabolism - targeted therapy of AML cells residual in the bone marrow microenvironment (2023)
  • 著者名/発表者名: Tabe Yoko、Konopleva Marina
  • 雑誌名: Cancer Drug Resistance 巻: 6 ページ: 138～150
  • DOI: 10.20517/cdr.2022.133
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 骨髄微小環境でのAML細胞のエネルギー代謝 (2022)
  • 著者名/発表者名: 田部 陽子
  • 雑誌名: 臨床血液 巻: 63 ページ: 1046～1051
  • DOI: 10.11406/rinketsu.63.1046
• [雑誌論文] Inhibition of BCL2A1 by STAT5 inactivation overcomes resistance to targeted therapies of FLT3-ITD/D835 mutant AML (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamatani K,Ai T,Saito K,Suzuki K,Hori A,Kinjo S,Ikeo K,Ruvolo Vi,Zhang W,Mak PY,Kaczkowski B,Harada H,Katayama K,Tabe Y,Andreeff M et al
  • 雑誌名: Translational Oncology 巻: 18 ページ: 101354～101354
  • DOI: 10.1016/j.tranon.2022.101354
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Molecular Profiling of Response and Resistance to Venetoclax Decitabine Therapy in Acute Myeloid Leukemia. (2023)
  • 著者名/発表者名: Abdullah Khasawneh, Faith Jessica Paran, Rieko Oyama, Abhishek Maiti, Hussein A Abbas, Bofei Wang, Poonam N Desai, Kala Hayes, Joe R Harman, Xiaoping Su, Courtney D. DiNardo, Michael Andreeff, Thomas Milne, Marina Konopleva, Yoko Tabe
  • 学会等名: 65th American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition
  • 国際学会
• [学会発表] Targets of Metabolic Alteration in Venetoclax / Decitabine Resistant Acute Myeloid Leukemia. (2023)
  • 著者名/発表者名: Kotoko Yamatani, Tatsuro Watanabe, Kaori Saito, Abhishek Maiti, Satoshi Yamashita, Abdullah Khasawneh, Faith Jessica Paran, Kala Hayes, Gautam Borthakur, Joe R Harman, Shinya Kimura, Courtney DiNardo, Thomas Milne, Michael Andreeff, Yoko Tabe, Marina Konopleva
  • 学会等名: .65th American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition
  • 国際学会
• [学会発表] Biomarkers of clinical resistance to Decitabine and Venetoclax therapy inferred by transcriptome and methylation analyses (2022)
  • 著者名/発表者名: Kotoko Yamatani, Abhishek Maiti, Tatsuro Watanabe, Kaori Saitoh, Kala Hayes, Kanako Kinjo, Kazuho Ikeo, Takashi Miida, Shinya Kimura,Courtney D. DiNardo, Su Xiaoping, Yoko Tabe, Marina Konopleva
  • 学会等名: 64th American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition
  • 国際学会
• [学会発表] Diverse mechanisms of resistance to Decitabine and Venetoclax therapy in newly diagnosed and relapsed/refractory AML inferred by transcriptome analysis (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamatani K、Tabe Y
  • 学会等名: 17th Congress of Asian Society of Clinical Pathology and Laboratory Medicine
  • 国際学会
• [学会発表] 骨髄微小環境でのAML細胞のエネルギー代謝 (2022)
  • 著者名/発表者名: 田部 陽子
  • 学会等名: 第84回日本血液学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] ミトコンドリアがつなぐ多彩な疾患研究最前線 (2022)
  • 著者名/発表者名: 田部 陽子
  • 学会等名: 第95回日本生化学会大会
  • 招待講演