難治性急性リンパ性白血病に対するプレシジョン・メディシンを目指した多分野融合研究

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22H03037
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 犬飼 岳史 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (30293450)
• 研究分担者: 原間 大輔 山梨大学, 大学院総合研究部, 医学研究員 (10774078) ; 大城 浩子 山梨大学, 大学院総合研究部, 医学研究員 (50377537) ; 合井 久美子 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (70324192) ; 赤羽 弘資 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (90377531) ; 玉井 望雅 山梨大学, 大学院総合研究部, 臨床助教 (90747453)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: 急性リンパ性白血病 / 難治性 / 薬剤感受性 / ゲノム編集 / 個別化治療

研究実績の概要

本研究は、主として難治性の急性リンパ性白血病症例から樹立された多数の細胞株を活用して、薬剤感受性と関連するゲノム情報を同定する新たな取り組みである。各株の多様な化学療法剤・低分子化合物・細胞傷害因子の感受性とゲノム情報をデータベース化し、難治性白血病における薬剤感受性モデルとしての有用性について成果をあげてきた。加えて、ゲノム編集技術を積極的に活用して、薬剤耐性に関与するゲノム異常を内因性の遺伝子に導入し、ALLの薬剤耐性におけるモデル系を構築することにも努めてきた。
本年度の論文成果としては、Philadelphia染色体陽性(Ph+)白血病に対するTKI療法において臨床的に大きな問題となるBCR::ABL1融合遺伝子のT315I変異を、はじめてヒトのリンパ球系白血病細胞株にCRISPR/Cas9による相同組み換えで導入することに成功した(Int J Hematol.2022;116:534)。さらに、BCR遺伝子とABL1遺伝子の転座切断点をCRISPR/Cas9によって同時に切断することによって、ヒト白血病細胞株において人工的にPhiladelphia染色体の形成を誘導することに世界で初めて成功した(Cancer Gene Ther.2023;30:38)。また小児ALLの維持療法の基本薬である6MPに対して特異的な耐性を誘導し、再発に深く関与するNT5C2およびPRPS1遺伝子におけるhotspot変異のうち、R39Q変異とS103N変異を、CRISPR/Cas9による相同組み換えで導入することに世界で初めて成功した(Mol Pharmacol.2023;103:199)。これら細胞系は、難治性白血病のモデル実験系として、新たな治療方法の検証に極めて有用なツールとなることが期待できる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今年度の研究では、B前駆細胞性ALL株100株とT-ALL株21株の合計121株を対象にして、total RNAによるRNA-seqをIllumina NovaSeq 6000を用いて26.7M readsの取得リード数で実施した。これによって、今後は薬剤感受性やゲノム異常と遺伝子発現との関連性について、網羅的に評価することが可能となっている。
続いて、TP53遺伝子の変異が小児ALLにおける化学療法感受性に対して及ぼす影響を明らかにするとともに、TP53遺伝子に変異があっても感受性が維持される薬剤をスクリーニングすることを目的に、TP53遺伝子に変異を持たず種々の化学療法剤に高感受性を示すBCP-ALL細胞株の11株とT-ALL細胞株1株の合計12株において、CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いてTP53遺伝子のノックアウトを試み、TP53-null亜株の樹立に成功している。これら12株では、TP53遺伝子がwild typeの親株と、TP53-nullの亜株をペアで保有することになり、世界に類のない貴重な研究材料となる。
さらにPh陽性白血病細胞株のBCR::ABL1遺伝子に、極めて強いTKI耐性を誘導するT315MおよびT315I変異とのcompound変異をCRISPR/Cas9による相同組み換えによって導入することに成功している。また、新たなゲノム編集技術であるBase editing法を用いて、T315I変異をsingle alleleのBCR::ABL1遺伝子にのみ導入することにも成功した。加えて、TP53遺伝子に新たに同定した変異をBase editing法によって導入することにも成功した。これらの変異体を導入した亜株を活用して、各変異の薬剤感受性への影響について解析を進めている。

今後の研究の推進方策

本研究では、小児ALL治療において基本となる化学療法剤のそれぞれの感受性を規定するゲノム情報を、白血病細胞株をモデル系として、遺伝子多型・変異・エピゲノム修飾の3つの視点から探索し、その関連性を臨床検体の公開データベースとゲノム編集技術を活用して検証して、信頼度の高い感受性バイオマーカーを同定することで、将来的な個別化治療への道を拓くことを目指す。 本研究は、薬剤感受性のゲノムマーカーを、圧倒的な規模の白血病細胞株バンクを活用し薬物動態に基づく感受性を評価して探索するという、類のない取り組みである。本研究は、多様な研究者と連携して白血病治療の個別化治療を目指すものであり、他のがん種への応用や「白血病とは何か」という根源的課題への成果も期待される。 具体的には、細胞株バンクの規模と薬剤感受性・ゲノム情報の強化を継続しつつ、前年度からの「胃がんのアスパラギナーゼ感受性」、「スーパーエンハンサーの機能解析」、「ゲノム編集による薬剤耐性遺伝子変異モデル」、「NUDT15 KO・ゼブラフィッシュの6MP感受性」の研究を継続・発展させる。 また、本年度からは「網羅型研究」として、一塩基多型・遺伝子変異・メチル化についてゲノム情報を網羅的に解析して薬剤ごとに解析を進めて、薬剤感受性マーカーの候補となるゲノム情報を検討する。さらに、「探索型研究」として、化合物及びCRISPRの各ライブラリーを用いて、新たな治療薬及び薬剤感受性遺伝子のスクリーニングを推進する。

研究成果

• [国際共同研究] Karolinska Institutet(スウェーデン)
  • 国名: スウェーデン
  • 外国機関名: Karolinska Institutet
• [国際共同研究] National University of Singapore(シンガポール)
  • 国名: シンガポール
  • 外国機関名: National University of Singapore
• [国際共同研究] National Taiwan University(その他の国・地域)
  • 国名: その他の国・地域
  • 外国機関名: National Taiwan University
• [国際共同研究] All India Institute of Medical Sciences(インド)
  • 国名: インド
  • 外国機関名: All India Institute of Medical Sciences
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9-Mediated Induction of Relapse-Specific NT5C2 and PRPS1 Mutations Confers Thiopurine Resistance as a Relapsed Lymphoid Leukemia Model (2023)
  • 著者名/発表者名: Nguyen Thao Thu Thi、Tanaka Yoichi、Sanada Masashi、Hosaka Masumi、Tamai Minori、Kagami Keiko、Komatsu Chiaki、Somazu Shinpei、Harama Daisuke、Kasai Shin、Watanabe Atsushi、Akahane Koushi、Goi Kumiko、Inukai Takeshi
  • 雑誌名: Molecular Pharmacology 巻: 103 ページ: 199～210
  • DOI: 10.1124/molpharm.122.000546
  • 査読あり
• [雑誌論文] Synergistic effect of combined PI3 kinase inhibitor and PARP inhibitor treatment on BCR/ABL1-positive acute lymphoblastic leukemia cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Hiroki Haruka、Akahane Koshi、Inukai Takeshi、Morio Tomohiro、Takagi Masatoshi
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 117 ページ: 748～758
  • DOI: 10.1007/s12185-022-03520-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] BCL6 inhibition ameliorates resistance to ruxolitinib in <i>CRLF2</i>-rearranged acute lymphoblastic leukemia (2022)
  • 著者名/発表者名: Tsuzuki Shinobu、Yasuda Takahiko、Goto Hiroaki、Maeda Naoko、Akahane Koshi、Inukai Takeshi、Yamamoto Hideyuki、Karnan Sivasundaram、Ota Akinobu、Hyodo Toshinori、Konishi Hiroyuki、Hosokawa Yoshitaka、Kiyoi Hitoshi、Hayakawa Fumihiko
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 108 ページ: 394～408
  • DOI: 10.3324/haematol.2022.280879
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Creation of Philadelphia chromosome by CRISPR/Cas9-mediated double cleavages on BCR and ABL1 genes as a model for initial event in leukemogenesis (2022)
  • 著者名/発表者名: Tamai Minori、Fujisawa Shinichi、Nguyen Thao T. T.、Komatsu Chiaki、Kagami Keiko、Kamimoto Kenji、Omachi Kohei、Kasai Shin、Harama Daisuke、Watanabe Atsushi、Akahane Koshi、Goi Kumiko、Naka Kazuhito、Kaname Tadashi、Teshima Takanori、Inukai Takeshi
  • 雑誌名: Cancer Gene Therapy 巻: 30 ページ: 38～50
  • DOI: 10.1038/s41417-022-00522-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Prominence of NUDT15 genetic variation associated with 6‐mercaptopurine tolerance in a genome‐wide association study of Japanese children with acute lymphoblastic leukaemia (2022)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Yoichi、Urayama Kevin Y.、Mori Makiko、Arakawa Yuki、Hasegawa Daisuke、Noguchi Yasushi、Yanagimachi Masakatsu、Keino Dai、Ota Setsuo、Akahane Koshi、Inukai Takeshi、Hangai Mayumi、Kawaguchi Takahisa、Takagi Masatoshi、Koh Katsuyoshi、Matsuda Fumihiko、Manabe Atsushi
  • 雑誌名: British Journal of Haematology 巻: 199 ページ: 260～269
  • DOI: 10.1111/bjh.18405
  • 査読あり
• [雑誌論文] Low NUDT15 expression levels due to biallelic NUDT15 variants and 6‐mercaptopurine intolerance (2022)
  • 著者名/発表者名: Yoshida M, Brown SA, Moriyama T, Nishii R, Tsujimoto SI, Yamada Y, Yoshida K, Shirai R, Osumi T, Utano T, Fukano R, Kudo K, Sakaguchi K, Arakawa Y, Koh K, Sekiguchi M, Sekimizu M, Miyamura T, Ishida H, Inukai T, Tomizawa D, Kiyokawa N, Kato M, Yang JJ.
  • 雑誌名: British Journal of Haematology 巻: 199 ページ: 270～276
  • DOI: 10.1111/bjh.18375
  • 査読あり
• [雑誌論文] Introduction of the T315I gatekeeper mutation of BCR/ABL1 into a Philadelphia chromosome-positive lymphoid leukemia cell line using the CRISPR/Cas9 system (2022)
  • 著者名/発表者名: Nguyen Thao T. T.、Tamai Minori、Harama Daisuke、Kagami Keiko、Kasai Shin、Watanabe Atsushi、Akahane Koshi、Goi Kumiko、Inukai Takeshi
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 116 ページ: 534～543
  • DOI: 10.1007/s12185-022-03369-x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Glucocorticoid receptor gene mutations confer glucocorticoid resistance in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (2022)
  • 著者名/発表者名: Tamai Minori、Kasai Shin、Akahane Koshi、Thu Thao Nguyen、Kagami Keiko、Komatsu Chiaki、Abe Masako、Watanabe Atsushi、Goi Kumiko、Miyake Kunio、Inaba Toshiya、Takita Junko、Goto Hiroaki、Minegishi Masayoshi、Iwamoto Shotaro、Sugita Kanji、Inukai Takeshi
  • 雑誌名: The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 巻: 218 ページ: 106068～106068
  • DOI: 10.1016/j.jsbmb.2022.106068
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CN470 is a BET/CBP/p300 multi-bromodomain inhibitor and has an anti-tumor activity against MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemia (2022)
  • 著者名/発表者名: Imayoshi Natsuki、Yoshioka Makoto、Tanaka Kuniaki、Yang Shyh-Ming、Akahane Koshi、Toda Yuki、Hosogi Shigekuni、Inukai Takeshi、Okada Seiji、Maloney David J.、Nakahata Tatsutoshi、Takita Junko、Kato Itaru、Ashihara Eishi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 590 ページ: 49～54
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.12.078
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] TCF3::HLF陽性白血病の難治性病態とその克服 17;19転座型ALLにおける化学療法に対する耐性と免疫学的な抗白血病効果に対する高感受性の機序 (2022)
  • 著者名/発表者名: 犬飼岳史
  • 学会等名: 第64回日本小児血液がん学会
  • 招待講演
• [学会発表] p210 and p190 BCR::ABL1 induce different gene expression profiles in the artificial Philadelphia chromosome-positive leukemias created by CRISPR/Cas9 system (2022)
  • 著者名/発表者名: Tamai Minori, Nguyen Thao, Komatsu Chiaki, Kagami Keiko, Kasai Shin, Harama Daisuke, Akahane Koshi, Goi Kumiko, Inukai Takeshi
  • 学会等名: 第64回日本小児血液がん学会
• [学会発表] Establishment of a human acute lymphoblastic leukemia model with relapse-specific mutation of the TP53 gene using the prime editing system (2022)
  • 著者名/発表者名: Nguyen Thao, Tamai Minori, Inaba Toshiya, Nagamachi Akiko, Kagami Keiko, Harama Daisuke, Kasai Shin, Akahane Koshi, Goi Kumiko, Inukai Takeshi
  • 学会等名: 第64回日本小児血液がん学会