研究課題
本研究課題ではRNAプロセスの異常をU1 snRNAの機能に基づき、それぞれに特化した解析を行うことで、変異により引き起こされる細胞内RNAプロセスの異常を解明し、髄芽腫の病態を明らかにすることを目的とし研究を進めている。初年度は主に試料の収集と解析手法の確立を行った。U1 snRNA変異発現細胞株を２つの既存細胞株を用いて確立した。ヒト髄芽腫検体を協力機関より収集した。臨床検体に対して、RNAシークエンスとU1 snRNA変異の評価を行った。RNAシークエンスのデータを用いてスプライシング異常解析を行うと、これまでの結果と同様に約1,000遺伝子にスプライシング異常が同定されていることが確認できた。しかし、約７割のスプライシング異常は一部の症例でしか認められないため、共通して発現量の高い異常イベントを今後探索していく。スプライシング異常のさらなる解析のため、一分子ロングリードシークエンスを用いたスプライシング異常解析を進めている。テストランとしてデータを取得しており、このデータを用いて今後解析手法を整えていく。合わせて、シークエンス精度の評価を行いサンプル調整法やシークエンス条件を調整し、今後症例数を増やしていく予定である。RNA局在異常解析のためにsubRNA-seq手法の確立を行った。シークエンスを行い良好に分画が行われていることが確認できた。解析数を増やしていくとともに解析も進めていく予定である。次年度以降、データの集積を進めていき、腫瘍の発生もしくは維持に必要な異常なイベントを探索していく。
2: おおむね順調に進展している
変異型U1 snRNAを有する髄芽腫細胞株はこれまでのところ樹立されていない。そのため、変異型U1 snRNAを発現する細胞株を確立している。レンチウイルスベクターにU1 snRNAのプロモーター領域と下流の3′end box領域を含んだ配列をクローニングして組み込み、SHH型髄芽腫の細胞株であるDaoyおよびONS76に感染させることで、野生型および変異型U1 snRNAを発現する細胞株を確立した。5′RACE法を用いて変異型U1 snRNAの発現が確認している。ヒト髄芽腫症例は協力機関より、合計173例のDNA/RNAの収集を行った。RNA-seqのよる髄芽腫のサブグループの同定および、rhAmp SNPジェノタイピングシステムによるU1 snRNA変異の解析を完了している。スプライシング異常の解析においては、ショートリードによるRNA-seqを用いてスプライシング異常解析を完了した。公開データとの比較により、約3割の異常スプライシングイベントは共通して存在していることが確認できた一方、残りは確認がされず、多くのpassengerイベントが生じていることが示唆された。ナノポアシークエンサーによるdirect RNAシークエンスはテストランとして一例のシークエンスを行った。RNA局在解析のためのsubRNA-seq手法を確立している。確立した細胞株を使用し、各分画に対して抗体染色を行い、濃縮を確認しシークエンスを行った。遺伝子発現に基づいたクラスタリングを行うと細胞分画毎で異なった遺伝子プロファイルを示していることが確認され、分画は良好に行われていることを確認した。U1 snRNA変異の導入により、クロマチン領域で1,353個の遺伝子発現が有意に変化していることを確認している。
スプライシング解析のために一分子ロングリードシークエンスを用いたdirect RNAシークエンスを進めていく。Direct RNシークエンス用の解析パイプラインを構築し、テストランを行ったデータの解析を進め品質を評価。ライブラリー作成方法やシークエンス条件の検証を行い、症例数を増やしてデータを蓄積していく。ショートリードシークエンスデータと比較を行い、その精度を評価していく。また、同定されたisoformに対してはそれぞれの機能ドメインがどのように変化しているか評価を行う。共通してみられるスプライシング変化に関しては、ショートリードシークエンスのデータも用いて、同じ異常isoformが発現していないか再解析を行うことで、症例数および感度の向上を図る。U11解析のために、確立した細胞株に変異を導入し、シークエンスを行っていく。また、収集した臨床検体においても変異症例が無いかgenotypingを行っていく。公開データ収集をすすめ、U11 snRNA変異を有する症例の検索を行いデータの集積していく。得られたシークエンスデータはスプライシング異常解析を行うとともに、U1 snRNAの結合配列の検索と関連を解析していく。subRNA-seqはシークエンス症例数を増やしてデータを蓄積する。また、発現差異解析のみならず、U1 snRNA結合部位のモチーフ検索やpathway解析を行っていく。また、臨床凍結検体においては、細胞質のRNAを分画することは困難と考えられるが、核抽出を行い、核膜とクロマチン領域の解析を行うことができる可能性があり、条件検討を行っていく。
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Cancer Science
巻: 114 ページ: 741～749
10.1111/cas.15691
Nature
巻: 612 ページ: E12～E12
10.1038/s41586-022-05578-0
