| 研究課題/領域番号 |
22H03254
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
波多 賢二 大阪大学, 大学院歯学研究科, 准教授 (80444496)
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| 研究分担者 |
奥崎 大介 大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 特任准教授(常勤) (00346131)
宇佐美 悠 大阪大学, 大学院歯学研究科, 講師 (80444579)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | 軟骨細胞 |
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| 研究実績の概要 |
2022年度はシングルセルRNA-seqの解析と、シングルセルATAC-seqのデータ抽出を行った。
まず、Col11-Enh-CreマウスとROSA26-CAG-LSL-ZsGreenマウスを交配し、軟骨細胞がZsGreenで標識されたCol11-Enh-ZsGreenマウスを作製した。全ての分化段階の成長板軟骨細胞が出現する胎生期15日目のCol11-Enh-ZsGreenマウスの四肢をコラゲナーゼ処理により1細胞レベルまで分離した後、セルソーターを用いてZsGreen陽性細胞、すなわち成長板軟骨細胞のみを回収し、10xChromiumシステムを用いてscRNA-seqを行った。次世代シークエンサーにより得られたデータを解析し、成長板軟骨細胞の全ての細胞のクラスタリングとその特異的遺伝子を抽出した結果、成長板軟骨細胞を従来の４段階ではなく、分化移行期を含む８つの細胞集団に分類し、それぞれのマーカー遺伝子を同定することに成功した。
次に、同様のアプローチで胎生期15日目のCol11-Enh-ZsGreenマウスの四肢をコラゲナーゼ処理からセルソーターによる細胞回収を行ったのち、ジギトニン処理を４分間行うことで細胞核の抽出を行った。すべての細胞核をバルクでトランスポーズ処理した後、Chromium Controllerで10xバーコードがついたゲルビーズを加えてトランスポーズ処理したDNA断片を10xバーコードでラベルした。最終的に、次世代シークエンサーで解析を行いシングルセルATAC-seqデータとして抽出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の核となるscRNA-seqならびにscATAC-seqを2022年度に終えることが可能となったため、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2023年度はシングルセルRNA-seqの遺伝子発現プロファイルとエピゲノム情報（scATAC-seq）の統合解析と移行期に重要な遺伝子群の抽出を主に研究を行う。まず、2022年度に取得したscATAC-seqの世代シークエンサーデータを、RパッケージSignacおよびSeruratを用いて解析する。具体的にはデータ読みこみとフィルタリングを行った後、次元圧縮→クラスタリング→二次元描画を行う。scATAC-seqのプロットから細胞クラスターのアノテーションを行うことは困難であるため、scRNAseqから同定した細胞種クラスターをscATAC-seqデータ上に投影させる。その際に、scATAC-seqデータより算出したgene activityを用いる。そして、成長板軟骨細胞の細胞をCol2a1,IhhおよびCol10a1の遺伝子発現ならびにエピゲノム情報を基準に分化段階に応じてクラスタリングする。そして、軟骨細胞分化の移行期に特異的な遺伝子と遺伝子近傍のオープンクロマチン領域を同定し、遺伝子発現とエピゲノムが軟骨細胞分化に伴ってどのように連携していくかを明らかにする。さらに、ChIP-MS法により細胞分化の移行期においてオープンクロマチン領域に結合し機能する転写制御因子を同定する。同定した転写制御因子を過剰発現させた軟骨細胞でRNA-seqやChIP-seq行うことで、転写制御因子が結合する領域をゲノムワイドに検出する。最終的にはこれらのデータを統合し、分化移行期の軟骨細胞における遺伝子発現の分子メカニズムの全貌を解明する。
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