| 研究課題/領域番号 |
23K27806
|
|---|
| 配分区分 | 基金 |
|---|
| 研究機関 | 九州大学 |
|---|
研究代表者 |
高橋 一郎 九州大学, 歯学研究院, 教授 (70241643)
|
|---|
| 研究分担者 |
吉崎 恵悟 九州大学, 歯学研究院, 助教 (10507982)
寺尾 文恵 九州大学, 歯学研究院, 助教 (10510018)
竹下 信郎 九州大学, 歯学研究院, 共同研究員 (50431515)
井上 茜 九州大学, 歯学研究院, 特別研究員 (70967752) [辞退]
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2026-03-31
|
| キーワード | 機械的伸展刺激 / Mechanosenstive miRNA / 軟骨細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では、In vitro における下顎頭軟骨特異的 mechanosensitive miRNA の機能解析系を確立するため、軟骨細胞におけるメカニカルストレスに応答した下顎頭軟骨特異的 mechanosensitive miRNA 発現変化の in vitro 解析を行った。成長板軟骨と下顎頭軟骨における miRNA の発現パターンをマイクロアレイ法を用いて検討し、下顎頭軟骨特異的 mechanosensitive miRNA の発現をリアルタイムPCR で解析した。また、下顎頭軟骨細胞へのメカニカルストレスにより発現上昇するmiR-29a、-134、-145a、-152、および -431 の５個のmechanosensitive miRNA の発生・成長期生体における発現局在を、成長板軟骨と比較して解析するために、in situ hybridization (ISH) を行うための準備として、それぞれのプローブを作製した。加えて、マウスから下顎頭軟骨細胞ならびに成長板軟骨細胞を単離し、ストレッチチャンバーに播種した後、力を負荷し、下顎頭軟骨特異的 mechanosensitive miRNA の発現をリアルタイムPCR で解析した。
一方、初代培養系の細胞でデータを得るのは困難であったことから、これらに加えて株化軟骨細胞 ATDC5 を利用することも有用と考え、そうした実験系の確立にも取り組んだ。この結果、まず、軟骨特異的な分子の遺伝子発現が機械的刺激に伴って変動することが示され、特に、伸展刺激によりSox9, Col2a1, Col10a1 などの発現が抑制されることが示された。また、偶発的に見出された結果ではあるが、この機械的刺激応答の過程には、Microtubules が関与していることが示された。
|
| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
3: やや遅れている
理由
理由
研究の進捗状況にも記載したが、当初の予定では、in vivo の実験から結果が明確になるものと考えていた。しかしながら、動物実験だけでは仮説通りの結果が出ているかどうか明確ではなかった。この問題を解消するためには、株化細胞を用いた実験系が適切であると考えられた。このため、ATDC5 などの株化軟骨細胞を利用する実験系を確立して研究を継続した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
研究の現在までの進捗状況にも記載したとおり、より、確実な結果を得ることを目的として、細胞株を利用した研究を追加して行うこととした。また、RNA プローブを用いた WMISH を実施し、miRNA の発現パターンを確定する。マウスから下顎頭の摘出、あるいは胎齢10日の四肢胚器官培養を行い、miRNA mimic と inhibitor をエレクトロポレーションにより遺伝子導入する。それらの下顎頭ならびに四肢胚を器官培養したのち、軟骨の発生に関わる因子の発現解析を行う。さらに、培養によってあられる軟骨組織から total RNA を精製し、リアルタイムPCR により下顎頭軟骨特異的 mechanosensitive miRNA の発現と各種マーカー分子の発現の定量評価を行う。すなわち、軟骨細胞分化・増殖マーカーの発現を解析し、下顎頭軟骨特異的 mechanosensitive miRNA 発現局在との比較検討を行う。
|
