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2023 年度 実施状況報告書

環境DNAのメチル化修飾から辿る,魚類の繁殖と齢構造を捉えるモニタリング手法開発

研究課題

研究課題/領域番号 23KJ1569
研究機関神戸大学

研究代表者

平山 一槻  神戸大学, 人間発達環境学研究科, 特別研究員(DC1)

研究期間 (年度) 2023-04-25 – 2026-03-31
キーワード環境DNA / DNAメチル化 / バイサルファイトシーケンス / 繁殖 / 産卵 / 魚類
研究実績の概要

環境DNAのメチル化解析によってゼブラフィッシュの繁殖活動(配偶子の放出)を追跡できることを水槽実験レベルで明らかにした。さらに野外で魚類繁殖活動の検出を行うためのマーカーとして、精子特異的な低メチル化状態のゲノム領域を探索した。対象種は絶滅危惧1B類のカワバタモロコとした。魚類で共通したメチル化パターンを示す候補遺伝子を過去の研究文献から整理し、カワバタモロコの上皮組織および精子から抽出したゲノムDNAを用いて領域特異的バイサルファイトシーケンスを実施した。カワバタモロコのホメオボックス遺伝子群を含むゲノム領域は精子特異的に低メチル化しており、うちいくつかのCpG塩基部位は殆どメチル化していなかった。

環境DNAにダメージを与えやすく塩基置換を生じさせるバイサルファイト(亜硫酸水素塩)を使用しないメチル化解析手法として、メチル化依存性制限酵素およびメチル化感受性制限酵素の使用を検討した。メチル化依存制限酵素でカワバタモロコのゲノムDNAを処理すると、上皮組織由来の高メチル化DNAは切断されてPCR増幅が起こりにくくなり、また反応時間を延長することで結果が明瞭となった。一方で、精子由来の低メチル化DNAはメチル化依存性制限酵素の影響を受けずPCRによって増幅された。

手法開発と並行して、環境DNAのメチル化解析の有効性を調べるためのサンプリングを実施した。野外環境でカワバタモロコの繁殖活動および個体群齢組成の変化をモニタリングするため、大学構内のビオトープで隔週の採水を1年間継続して行った。水サンプルをろ過、DNA抽出して環境DNA濃度を定量した結果、カワバタモロコのDNAは繁殖期の初夏にかけて増加しており、また精子DNAの放出を示す核DNA/ミトコンドリアDNA濃度比の変化も見られた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

いずれの計画も順調であり、当初の予定通りに進行している。

今後の研究の推進方策

バイサルファイトシーケンスを行ったカワバタモロコのゲノム領域中に、環境DNA検出用のプライマー・プローブを設計し、ビオトープの1年分の環境DNAサンプルでメチル化解析(精子特異的低メチル化DNAの検出)を実施する。また、ゼブラフィッシュの卵巣および成熟卵に多く含まれる卵型18SリボソームDNAの配列解析および特異的検出系の開発を並行して行う。

  • 研究成果

    (3件)

すべて 2024 2023

すべて 学会発表 (3件) (うち国際学会 2件)

  • [学会発表] 環境DNAのメチル化解析に基づく魚類繁殖活動の検 出2024

    • 著者名/発表者名
      平山一槻, 呉盧漢, 源利文
    • 学会等名
      第71回日本生態学会横浜大会
  • [学会発表] Application of DNA methylation analysis to eDNA studies2023

    • 著者名/発表者名
      Itsuki Hirayama, Wu Luhan, Toshifumi Minamoto
    • 学会等名
      The eDNA Society International Meeting 2023
    • 国際学会
  • [学会発表] Methylation Analysis of Environmental DNA for Breeding Monitoring of Fish2023

    • 著者名/発表者名
      Itsuki Hirayama, Wu Luhan, Toshifumi Minamoto
    • 学会等名
      British Ecological Society Annual Meeting 2023
    • 国際学会

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公開日: 2024-12-25  

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