| 研究課題/領域番号 |
24221008
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| 研究種目 |
基盤研究(S)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
山田 啓文 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40283626)
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| 研究分担者 |
小林 圭 京都大学, 学内共同利用施設等, 助教 (40335211)
平田 芳樹 独立行政法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (10357858)
野田 啓 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (30372569)
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| 研究期間 (年度) |
2012-05-31 – 2017-03-31
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| キーワード | ナノ計測 / 原子間力顕微鏡 |
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| 研究概要 |
本研究課題では、液中高分解能FM-AFMイメージング技術およびデュアルプローブAFM技術を基盤として、生体膜上のさまざまな機能性分子の機能情報と構造情報を分子スケールで識別、可視化する、新たな分子機能イメージング法を確立し、これら生体分子の細胞生理機能における微視的役割を解明することを目的としている 。デュアルプローブAFM による機能イメージングでは、2つの機能の異なる探針がほぼ同一の観察領域を走査することが前提となっており、高分解能イメージングのためには、微小走査領域においてもが観察像が十分重なるよう、これら2つの探針を100 nm以内に接近させる必要がある。本年度は、探針位置の精密制御のため、最小移動ステップ幅が10 nm以下の3軸移動可能なステージを有する慣性駆動機構を、現有のデュアルプローブAFM装置に組み込み、再現性よく位置決め可能な、探針の近接制御技術を確立した。
本研究においては、複数のAFM探針が接近して動作することになるため、その先端がカンチレバー部分に対して前方に突き出している構造をもつSiカンチレバーを主に使用する(例えばナノセンサーATEC)。本年度は、これらSi製カンチレバーの探針表面に分子修飾を施し、生化学修飾探針を作製した。具体的には、探針表面のシリコン酸化膜表面と結合反応することが可能な表面修飾剤表面修飾剤を設計・合成して利用した。この表面修飾剤は分子内に酸化シリコン表面と化学・結合するトリエトキシシラン基と、N-ヒドロキシコハク酸イミド基を持ち、前者は探針のシリコン表面に結合し、後者は抗体・抗体分子などリガンドのタンパク質分子表面のアミノ基と共有結合を生成し、探針表面を任意のリガンド分子で覆うことが可能となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、おおむね順調に進展している。デュアルプローブAFMによる機能イメージングでは、２つの異なる、各々の探針に、構造観察および生化学機能イメージングの役割をもたせるため、２つの探針がほぼ同一の観察領域を走査することが前提となるが、今年度の研究では、サブ研究テーマ「(1) 液中マルチプローブAFM の高度化」において、最小移動ステップ幅が10 nm以下の慣性駆動型の探針駆動機構を組み込み、再現性の高い探針近接制御技術を目標通り実現した。これにより、２つの独立した探針で同一の観察領域を同時に観察し、通常探針で得られる形状信号と、生化学修飾探針で得られる信号の差分を計測することで生化学的相互作用の可視化を実現するという本研究の目標の一つへ向けて、着実に装置の高度化を進めることができたといえる。また、もう一方のサブ研究テーマ「(2)生化学修飾探針の作製」では、デュアルプローブAFMにおいて２探針の先端どうしを近接させる際に必須となる、探針先端がカンチレバー部分に対して前方に突き出しているタイプのSi 製カンチレバーに対し、金属コーティングを施すことなく、シラン結合・アミド結合を介して、リガンド分子を結合させることに成功した。以上、当初目的に沿って、広範に応用可能な生化学修飾探針を実現することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに開発された、高度な液中プローブ計測技術により、マイカのような原子的平坦性を有する結晶表面上における精密な相互作用計測が可能となり、例えばフォースマッピング法により水和構造の３次元可視化が可能となったが、生体分子においては、その表面構造は極めて複雑な形状であることが多く、このためフォースマッピング法における探針制御をさらに精密かつ正確に行う必要がある。今後、探針制御のアルゴリズムの検討、探針駆動制御の周波数帯域の改善し、３次元的に複雑な表面上においても高精度で探針が追従するように追従可能なフォースマッピング法の確立を目指す。
また、これまでに作製した生化学修飾探針を用いて、実際にターゲットとなる生体分子の特異的相互作用が検出可能であることを検証する。具体的には、これまでの表面化学修飾の設計・試作を基に、チオール基(-SH)を介してポリエチレングリコール(polyethyleneglycol: PEG)修飾された金コート探針や、シラン修飾されたシリコン探針などを用いて、 最終的に所望のターゲット試料に特異的に結合するリガンド分子を結合させた生化学修飾探針を作製する。
以上の要素技術を基に、FM-AFMを用いて、保存的相互作用力や散逸的相互作用力、さらにはその高調波応答を検出することにより、修飾探針と生体分子間にはたらく特異的相互作用の検出を試みる。
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