| 研究課題/領域番号 |
24221008
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
山田 啓文 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40283626)
|
|---|
| 研究分担者 |
小林 圭 京都大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (40335211)
平田 芳樹 独立行政法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (10357858)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2012-05-31 – 2017-03-31
|
| キーワード | ナノ計測 / 原子間力顕微鏡 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究課題では、これまで申請者らによって開発されてきた、液中高分解能FM-AFMイメージング技術およびデュアルプローブAFM 技術を基盤として、機能情報と構造情報を分子レベルで識別・可視化する新たな分子機能イメージング法を確立し、生体分子の細胞生理機能における微視的役割を解明することを目的としている。
(1) 生化学修飾探針の改善およびその動作検証：基板上に展開したIgG抗体分子膜上でのフォースカーブ測定では、抗原修飾探針による測定と通常探針（非修飾探針）による測定の間に明確な違いが確認され、これによって抗原-抗体間の特異的相互作用を評価することができた。一方で、この生化学修飾探針によるフォースカーブ測定の再現性には問題があり、定量測定の観点からもその改善が課題となっている。測定の安定性にはリンカー部の影響が大きいと考えられることから、リガンド分子と探針をつなぐリンカー部の最適化を図った。特異結合過程はそもそも確率過程的側面をもつため完全な再現性は望めないものの、上記対策によって、フォースカーブ測定の安定性は十分許容できる範囲にまで向上した。
(2) 生体分子近傍の静電相互作用可視化に向けた固液界面静電計測：生体分子は、周囲のイオン濃度やpHなどに応じてその表面電荷分布を変えるが、この変化は生体分子間相互作用に直接的に影響を与える。電解質中に存在する電荷はその周りに電気二重層を形成するため、大気、真空中と比べて、静電気力測定は遥かに複雑となる。本年度は、生体分子近傍の静電相互作用可視化に向けた予備的実験として、電荷分布・構造が既知のDNA/ポリLリジン膜系と探針の間にはたらく局所静電気力（電気二重層力）をフォースカーブ法により測定し、この測定結果を先行研究と比較することで測定の有効性を調べた。この結果、電気二重層力計測を通して局所静電気力を測定できることが確認された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究はおおむね順調に進展している。本研究課題は、４つの研究サブテーマから構成されるが、本年度は、その中の２つのサブテーマの研究が密接に連携して進められており、生体分子構造・機能計測を確立するための具体的な研究が行われた。
サブ研究テーマ「(1) 生化学修飾探針の作製およびその動作検証」においては、生化学修飾探針とターゲット分子の特異的結合の効率化を目指して、主に探針とリガンドをつなぐリンカーを調整した。特異結合過程は基本的には確率過程的側面をもち、結合を確実に引き起こすことはできないが、リガンド分子の配向および結合範囲に柔軟性を持たせることで、十分許容できる範囲にまで結合確率を向上させ、フォースマッピング法による生体分子の機能計測が可能であることが確認された。
また、サブ研究テーマ「(2) 生体分子近傍の静電相互作用可視化に向けた固液界面静電計測」では、フォースマッピング法によってモデル試料上の各点での電気二重層力カーブのデータを取得し、その改善されたDLVO解析を行うことで、表面電荷密度や試料分子周囲のカウンターイオンの挙動を評価することができることを確認した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
(1) デュアルプローブAFM による生体機能可視化技術の確立：リガンド等の注入によってターゲット分子の機能を発現させ、その前後でのターゲット分子の変化を高分解能で直接的に捉えることは、生体分子の機能発現における微視的機構を探る上で非常に有効な手段である。しかしながら、通常の装置においては、上記分子等の注入は探針近傍の環境に大幅な擾乱をもたらし、注入後の高分解能観察を著しく阻害する。今後の研究では、ターゲット周辺のみに極微量の分子を注入するため、ピペット型ナノプローブを新たに開発し、デュアルプローブAFMに導入する。
(2) 生体分子周囲の水和構造可視化：局所２次元水和構造計測については、これまでの研究により、安定な高分解能計測が多くの生体試料系において可能となり、新たな知見が得られつつある。一方、試料が複雑な表面構造をもつ場合においても、３次元水和構造可視化（３次元フォースマッピング）を用いることで、試料構造と水和の関係を理解することは基本的に可能である。しかしながら、長時間、安定に動作する３次元測定は依然容易ではない。今後は、計測時間の短縮、装置系におけるさまざまなドリフト要因を改善することで、より精密な生体分子周囲の水和構造可視化のために、安定な３次元フォースマッピング法の確立を目指す。また、抗体分子など一部の生体分子系は柔構造を有しているが、こうした分子では、その柔構造に由来する大きな（表面）構造揺らぎのため、分子周囲に水和構造が生じないという結果が、これまでの研究で得られている。柔構造系の場合、エネルギー散逸信号にその影響が出ることも示唆されていることから、本研究では、散逸エネルギーの２次元/３次元同時マッピングを行うことで、生体分子揺らぎの直接可視化の実現を目指す。
|
