2012 年度実績報告書

革新的高輝度近赤外発光プローブの創製と生体内癌イメージングへの応用

研究課題

研究課題/領域番号	24225001
研究種目	基盤研究(S)
研究機関	慶應義塾大学
研究代表者	鈴木孝治慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (80154540)
研究分担者	佐藤守俊東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (00323501)
研究期間 (年度)	2012-05-31 – 2017-03-31
キーワード	化学センサー / 生物発光 / イメージングプローブ / ルシフェリン / ルシフェラーゼ
研究概要	本年度は、高輝度蛍光分子骨格を有するボロンジピロメテン（BODIPY）誘導体に、ホタルルシフェリンの酸化発光部位であるチアゾリン環を直結させた新規の生物発光基質を設計、合成した。BODIPYは様々な置換基を入れることで発光波長のバリエーションを持つことが知られているため、高輝度かつ様々な波長を発する基質の開発が可能であると考えている。この新規BODIPY生物発光基質は、化学発光（化学的酸化反応）させると、最大発光波長523 nmを示したが、ホタルルシフェリンを使った生物発光の場合には、強度は小さく、正確な発光波長は確認できなかった。一方、ホタル以外ではウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)による発光系が、高輝度が期待できる生物発光系であり、Rlucの基質であるセレンテラジン(CTZ)の誘導体についても検討した。この目的のため、CTZ 分子の5位の炭素部位に強固なフラン環構造を入れて架橋した新規誘導体(KCTZ-1)を設計し、その合成にも成功した。次に、KCTZ-1と反応して生物発光を生起する生物発光タンパク質（ルシフェラーゼ）をスクリーニングする目的で、様々な生物種由来のルシフェラーゼその変異体を用いて検討を行ったところ、１つのルシフェラーゼ変異体が当該合成基質に対して比較的高い生物発光活性を発揮することを見出した。しかもこの反応は、当該基質の化学発光に関する事前検討から予想される波長よりも、大幅に短波長の生物発光（430 nm）を生起することを明らかにした。KCTZ-1の生物発光は、同様の波長範囲で発光を示す市販のCTZ誘導体であるDeep Blue Cと比べ、27倍の発光と14倍の発光半減期を示した。従って、KCTZ-1は、青色発光を示すCTZ誘導体として、Deep Blue Cに代わる高輝度な基質として利用できることがわかった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 1: 当初の計画以上に進展している理由高輝度蛍光分子骨格を有するボロンジピロメテン（BODIPY）誘導体に、ホタルルシフェリンの酸化発光部位であるチアゾリン環を直結させた新規の生物発光基質を設計し、合成に成功した。合成蛍光物質BODIPYを生物発光基質として扱うことは大胆な発想である。この新規発光基質は、化学発光（化学的酸化反応）させると、最大発光波長523 nmを示したことは、基質としての有用性を示す。ここまでは十分な結果であるが、ホタルルシフェリンを使った生物発光の場合には、強度は小さく、正確な発光波長は確認できなかったため、今後新たな分子設計が必要である。ホタル以外では、ウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)による発光系のセレンテラジン(CTZ)が、高輝度が期待できる生物発光系であるため、Rlucの基質であるセレンテラジン(CTZ)の誘導体基質も検討した。CTZ 誘導体としては、5位の炭素部位に強固なフラン環構造を入れて架橋した新規誘導体(KCTZ-1)を設計し、その合成にも成功した。KCTZ-1は、化学発光において、CTZの約２倍の発光を示したので、明るい基質が得られたことになる。そこで、KCTZ-1と反応して生物発光を生起する様々な生物種由来のルシフェラーゼその変異体を用いて試したところ、１つのルシフェラーゼ変異体が比較的高い生物発光活性を示した。しかも事前検討から予想される波長よりも、大幅なブルーシフトを示し、生物発光は430 nmであった。幸いにもKCTZ-1の生物発光は、同様の波長範囲で発光を示す市販のCTZ誘導体であるDeep Blue Cと比べ、27倍の発光と14倍の発光半減期を示したことは評価に値する。つまり、KCTZ-1は、青色発光を示すCTZ誘導体として、Deep Blue Cに代わる高輝度な基質として利用できることを意味する成果を得た。
今後の研究の推進方策	本年度は、天然の基質であるセレンテラジン(CTZ)分子の5位の炭素部位を強固なフラン環構造を入れて架橋すると、発光波長がブルーシフトし、市販のブルーシフト基質であるDeep Blue Cより高輝度新規CTZ誘導体(KCTZ1)の設計、合成に成功した。そこで、このKCTZ-1を用いた短波長の生物発光システムを、その生物発光スペクトルとの重なりが大きい励起スペクトルを有し、かつストークスシフトが非常に大きい蛍光タンパク質（赤色～近赤外）と連結することにより、生物発光共鳴エネルギー（BRET）に基づいて、生体組織透過性の高い近赤外領域（650 nm～800 nmに）に強い生物発光を生起させることができる可能性があり、現在検討中である。さらに、CTZ分子の6位および8位の炭素を置換あるいは共役系で拡張した分子を設計合成し、それらの分子構造と発光特性の構造相関を詳しく調べる。その結果、天然基質のCTZの発光波長を長波長化させることが期待できる。一方、ホタルルシフェリンにおいては、分子構造相関を詳しく調べるために、酸化発光部位であるチアゾリン環にさまざまな合成蛍光色素を直結させた新規の生物発光基質を設計、合成する。さらに、様々な置換基を加えることで発光波長をコントロールできるかを検討する。得られた合成基質にマッチするルシフェラーゼを組み合わせて大幅に高輝度化すべく、ルシフェラーゼの合成基質結合部位近傍のアミノ酸残基を狙って変異を導入する。この部位特異的なセミランダム変異導入により生成した大量のルシフェラーゼ変異体を、それぞれ大腸菌に発現させ、それぞれのルシフェラーゼ変異体をハイスループットスクリーニングする。このように開発する変異体を用い、上述のBRETに基づく高輝度近赤外発光プローブのさらなる高輝度化を狙う。