小胞体ストレス応答の分子機構とその破綻による疾患機序の解明

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24228002
• 研究機関: 奈良先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 河野 憲二 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (50142005)
• 研究期間 (年度): 2012-05-31 – 2017-03-31
• キーワード: 小胞体 / ストレス応答 / 寄生虫感染 / ムチン産生 / インスリン分泌 / 膵島β細胞 / ストレスセンサー

研究概要

（1）小胞体膜上での特殊スプライシング機構の解析　　　XBP1uタンパク質の小胞体膜移行シグナル配列をもつHR2（約20アミノ酸）結合タンパク質をFlag-XBP1uを用いて質量分析をしたところ、候補タンパク質として、SRP（シグナル認識粒子）やトランスロコンの構成分子であるSec61などが単離されてきたので、今後はSRPが関与する経路がこの移行に貢献しているかどうかを調べる。また、XBP1u タンパク質の翻訳が一過的に休止する26アミノ酸配列を明らかにしたが、この翻訳休止機構を解析するためのレポーター作製を行った
（2）寄生虫排除に関与するIRE1βの生理機能解析　　　小腸に寄生虫（蠕虫: Nippostrongylus brasiliensis）が感染すると腸上皮からIL33が分泌され、Th2型応答が起こることが知られている。そこでIL33投与時のマウス小腸における杯細胞の変化を調べた結果、野生型では杯細胞数の増加と体積の顕著な増加が観察されるのに対し、IRE1βKOマウスでは両者とも抑制されていることがわかった。また産生されるムチン（Muc2）はIRE1βKOマウスでは、前駆体型ムチンが産生されており、小胞体が肥大化している電顕像が観察された。
（3）糖尿病発症におけるIRE1αの生理機能解析　　膵臓β細胞のみにSV40T抗原を発現しているIT-6マウスとIRE1αに関するKOマウスを交配し、膵島β細胞の遺伝子型が IRE1α(flx/flx)のβ細胞株を樹立した。その細胞にアデノウィルスを用いてCre酵素を導入しIRE1α(-/-)にした細胞も樹立した。これら両細胞を用いて，インスリン産生を調べたところ，IRE1αを破壊すると、インスリン産生の顕著な阻害が観察された。今後はこの細胞を用いて，インスリン産生をパルスチェイス法により詳細に解析する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

（1）のXBP1uタンパク質の小胞体膜への標的化機構は、シグナルペプチドをもつタンパク質が小胞体に向かうシステムを利用している可能性が高く，標的分子が絞られて来ており、大変順調に進んでいる。（2）に関しても、IL33投与時の小腸杯細胞の数及びその成熟度が，野生型マウス、IRE1βKOマウスを比較すると顕著な違いが観察されており、極めて順調に進んでいる。（3）に関しては、マウス膵島由来のβ細胞株を樹立できたので、それを用いて詳細な解析をしていくことが可能となった。

今後の研究の推進方策

（1）HR2がSRP-トランスロコン経路を利用しているかどうかをin vitro、in vivoの系を用いて確認する。また、XBP1uタンパク質の一過的翻訳停止機構を解析するための簡便なレポーター遺伝子を作製する。上記の系を利用することにより、XBP1u mRNAの特殊スプライシング機構の詳細を明らかにする。
（2）野生型マウス、IRE1βKOマウスに実際に寄生虫を感染し、その排虫能力に差がみられるかどうかを検討する。
（3）IRE1α欠損のマウス膵島β細胞でのインスリン産生について、顕著な阻害結果を得たので、IRE1α/ATF6αの二重欠損マウスを調べる前に、IRE1α欠損のマウスについて詳細な解析を行う。小胞体ストレスセンサーを欠損させることができるマウスから膵島β細胞を樹立したので、この培養細胞株を利用してインスリン産生におけるストレスセンサーの役割を詳細に解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Ethanol stress impairs protein folding in the endoplasmic reticulum and activates Ire1 in Saccharomyces cerevisiae. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miyagawa, KI., Ishiwata-Kimata, Y., Kohno, K., and Kimata, Y.
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem. 巻: 78 ページ: 1389-1391
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.921561
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A model of liver carcinogenesis originating from hepatic progenitor cells with accumulation of genetic alterations (2014)
  • 著者名/発表者名: Kim, S. K., Nasu, A., Komori, J., Shimizu, T., Matsumoto, Y., Minaki, Y., Kohno, K., Shimizu, K., Uemoto, S., Chiba, T., and Marusawa, H.
  • 雑誌名: Int. J. Cancer 巻: 134 ページ: 1067-1076
  • DOI: 10.1002/ijc.28445
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of the redox partners of ERdj5/JPDI, a PDI family member, from an animal tissue (2013)
  • 著者名/発表者名: Kadokura H., Saito, M., Tsuru, A., Hosoda, A., Iwawaki, T., Inaba, K., and Kohno, K.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 440(2) ページ: 245-250
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.09.063.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation (2013)
  • 著者名/発表者名: Adolph,T.E.,Tomczak,M.F.,Niederreiter,L.,Ko,H.J.,Bock,J.,Martinez-Naves,E.,Glickman,J.N.,Tschurtschenthaler,M.,Hartwig,J.,Hosomi,S.,Flak,M.B.,Cusick,J.L.,Kohno,K.,Iwawaki,T.,Billmann-Born,S.,Raine,T.,Bharti,R.,Lucius,R.,Kweon,M.N.,Marciniak,S.J.,Choi,A.,Hagen,S.J.,Schreiber,S.,Rosenstiel,P.,Kaser,A.,Blumberg,RS.
  • 雑誌名: Nature 巻: 503 ページ: 272-276
  • DOI: 10.1038/nature12599.
  • 査読あり
• [雑誌論文] ER stress transcription factor Xbp1 suppresses intestinal tumourigenesis and directs intestinal stem cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Niederreiter, L., Fritz, T. M. J., Adolph, T.E., Krismer, A. M., Offner, F. A., Tschurtschenthaler, M., Flak, M. B., Hosomi, S., Tomczak, M. F., Kaneider, N. C., Sarcevic, E., Kempster, S. L., Raine, T., Esser, D., Rosenstiel, P., Kohno, K., Iwawaki, T., Tilg, H., Blumberg, R. S., and Kaser, A.
  • 雑誌名: J. Exp. Med. 巻: 210(10) ページ: 2041-2056
  • DOI: 10.1084/jem.20122341.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neuropathic and inflammatory pain are modulated by tuberoinfundibular peptide of 39 residues. (2013)
  • 著者名/発表者名: Dimitrov, E.L., Kuo, J., Kohno, K., and Usdin, T.B.
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 巻: 110(32) ページ: 13156-13161
  • DOI: 10.1073/pnas.1306342110.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Actin filaments are required for efficient clustering of endoplasmic stress sensor Ire1. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishiwata-Kimata, Y., Yamamoto, Y.H., Takizawa, K., Hiraoka, Y., Kohno, K., and Kimata Y.
  • 雑誌名: Cell Struct. Funct. 巻: 38(2) ページ: 135-143
  • 査読あり
• [雑誌論文] Zinc depletion activates the endoplasic reticulum-stress sensor Ire1 via pleiotropic mechanisms. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nguyen, L.S.T., Kohno, K. and Kimata, Y.
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem. 巻: 77(6) ページ: 1337-1339
  • 査読あり
• [雑誌論文] MTP inhibition induces ER stress and increases gene transcription via Ire1α/cJun to enhance plasma ALT/AST. (2013)
  • 著者名/発表者名: Josekutty, J., Iqbal, J., Iwawaki, T., Kohno, K., and Hussain, M.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288(20) ページ: 14372-14383
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.459602.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A BiP-bound and non-clustered mode of Ire1 evokes a weak but sustained unfolded protein response. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishiwata-Kimata, Y., Promlek, T., Kohno, K., and Kimata, Y.
  • 雑誌名: Genes Cells 巻: 18(4) ページ: 288-301
  • DOI: 10.1111/gtc.12035.
  • 査読あり
• [学会発表] The importance of ribosome stalling in the unfolded protein response. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kenji Kohno
  • 学会等名: The 66th of Annual Meeting of the Japan Society for Cell Biology
  • 発表場所: 奈良県新公会堂・奈良県奈良市
  • 年月日: 20140611-20140613
  • 招待講演
• [学会発表] New aspects of regulation and function of the ER stress sensor Ire1 in yeast cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yuki Kimata-Ishiwata, Kenji Kohno, Yukio Kimata
  • 学会等名: The 66th of Annual Meeting of the Japan Society for Cell Biology
  • 発表場所: 奈良県新公会堂・奈良県奈良市
  • 年月日: 20140611-20140613
  • 招待講演
• [学会発表] 細胞系譜の異なる細胞から膵β細胞へのダイレクトリプログラミング (2014)
  • 著者名/発表者名: 森田この美、斉藤美知子、河野憲二
  • 学会等名: 第13回日本再生医療学会総会
  • 発表場所: 国立京都国際会館・京都府京都市
  • 年月日: 20140304-20140306
• [学会発表] 小胞体ストレスセンサーIre1αにスプライシングされるために必須なmRNAの構造及び配列の解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 池端悠介、河野未来、田丸良子、金谷重彦、岩脇隆夫、柳谷耕太、河野憲二
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド・兵庫県神戸市
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] 小胞体ストレスセンサーIre1の活性調節とストレス感知：サイトゾル側ドメインの関与 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小口能里枝、木俣有紀、河野憲二、木俣行雄
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド・兵庫県神戸市
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] N末端天然非変性領域による小胞体ストレスセンサーIre1の厳密な制御 (2013)
  • 著者名/発表者名: 塚本知子、Mathuranyanon Rubwad、河野憲二、木俣行雄
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド・兵庫県神戸市
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] 出芽酵母でのエタノール誘発性小胞体ストレスと防衛応答 (2013)
  • 著者名/発表者名: 宮川賢一、河野憲二、木俣行雄
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド・兵庫県神戸市
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] 寄生虫排除における小胞体ストレス応答の生理的役割 (2013)
  • 著者名/発表者名: 河野憲二
  • 学会等名: 第８回小胞体ストレス研究会
  • 発表場所: 金沢大学 医薬保健学域・石川県金沢市
  • 年月日: 20131025-20131026
• [学会発表] 膵臓β細胞でのIRE1αの機能解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 土屋雄一
  • 学会等名: 第８回小胞体ストレス研究会
  • 発表場所: 金沢大学 医薬保健学域・石川県金沢市
  • 年月日: 20131025-20131026
• [学会発表] 腸管寄生虫排除における小胞体ストレス応答の生理的役割 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小松 朋子, 都留 秋雄, ○ 河野 憲二
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜・神奈川県横浜市
  • 年月日: 20130911-20130913
  • 招待講演
• [学会発表] 小胞体ストレスセンサー Ire1による亜鉛イオンの細胞内分配制御 (2013)
  • 著者名/発表者名: Nguyen Sy Le Thanh、堤 智明、堂道京子、木俣有紀、○木俣行雄
  • 学会等名: 第46回 酵母遺伝学フォーラム研究報告会
  • 発表場所: 東北学院大学土樋キャンパス・宮城県仙台市
  • 年月日: 20130908-20130910
• [学会発表] The ER stress sensor Ire1 phosphorylates and stabilizes the ion transporter Zrg17 to enable proper zinc distribution in yeast cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yukio Kimata
  • 学会等名: Gordon Research Conference ”Stress Proteins in Growth, Development & Disease”
  • 発表場所: Mount Snow Resort, West Dover, VT, USA
  • 年月日: 20130707-20130712
• [学会発表] Regulation of the ER stress sensor Ire1 by its N-terminal intrinsically disordered region (2013)
  • 著者名/発表者名: Rubwad Mathuranyanon, Kenji Kohno, Yukio Kimata
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知県産業労働センター）・ 愛知県名古屋市
  • 年月日: 20130619-20130621
• [学会発表] Roles of IRE1b in gastrointestinal nematode expulsion (2013)
  • 著者名/発表者名: Tomoko Komatsu, Akio Tsuru, Koubun Yasuda, Sayo Takahashi, Tomohiro Yoshimoto, Kenji Nakanishi, Kenji Kohno
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知県産業労働センター）・愛知県名古屋市
  • 年月日: 20130619-20130621
• [学会発表] IRE1a is indispensable for the efficient production of insulin in pancreatic b cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Yuichi Tsuchiya1, Michiko Saito1, Takao Iwawaki2, Jun-ichi Miyazaki3, Kenji Kohno
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知県産業労働センター）・ 愛知県名古屋市
  • 年月日: 20130619-20130621
• [学会発表] Xbp1u mRNA utilizes its own translation product, the Xbp1u protein, to move specifically onto the ER membrane (2013)
  • 著者名/発表者名: Satoshi kanda, Kota Yanagintani,, Yukiko Yokota, Yuta Esaki, Kenji Kohno
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知県産業労働センター）・ 愛知県名古屋市
  • 年月日: 20130619-20130621
• [学会発表] The distinct roles of IRE1 paralogues in mammalian secretory cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Kenji Kohno
  • 学会等名: FASEB “ From Unfolded Proteins in the ER to Disease”
  • 発表場所: Vermont Academy, Saxtons River, VT, USA
  • 年月日: 20130616-20130621
  • 招待講演
• [学会発表] Fine regulation of yeast ER stress sensor Ire1 by its N-terminal intrinsically disordered region (2013)
  • 著者名/発表者名: Rubwad Mathuranyanon, Kenji Kohno, Yukio Kimata
  • 学会等名: FASEB “ From Unfolded Proteins in the ER to Disease”
  • 発表場所: Vermont Academy, Saxtons River, VT, USA
  • 年月日: 20130616-20130621
• [学会発表] インスリン産生細胞における小胞体ストレスセンサーIRE1αの機能解析
  • 著者名/発表者名: 土屋雄一、斉藤美知子、岩脇隆夫、宮崎純一、河野憲二
  • 学会等名: 日本農芸化学会関西支部第482回講演会
  • 発表場所: 神戸大学 兵庫県神戸市
• [備考] Kohno Lab. 動物細胞工学研究室
  • URL: http://bsw3.naist.jp/kouno/kouno.html
• [備考] 動物細胞工学（河野研究室）
  • URL: http://bsw3.naist.jp/courses/courses207.html