| 研究実績の概要 |
本研究は、TCRを介する活性化シグナルの制御機構を解析するために、シグナル伝達の場であるTCRミクロクラスターを介する活性化シグナルの実態をイメージング解析と共に、中心のTCR-CD3複合体の構造を解析することを目指している。シグナル伝達との関係を明らかにするために、TCR-CD3の細胞外領域だけではなく、膜貫通・細胞内領域を含む全長の複合体を解析する必要がある。膜貫通領域を含む蛋白を界面活性剤存在下でリポソームとして再構成する方法で各ダイマーを、その後全マルチマーを形成する方法をとった。
昨年度までにTCR(a,b), CD3(g,d,e,z)の各鎖を無細胞系で合成することに成功した。今年度まで計画を延長させたのは、これら合成蛋白を使いダイマー、および全マルチマーの形成と精製を成功させるためである。各々に異なるtagを付けて合成し、ダイマー形成の為に、in vitroでtag切断できるように工夫した。ダイマー形成の量比を変化させて最大量になるようにし、CD3の各ダイマー：CD3ge, CD3de, CD3zzの形成に成功した。しかし、CD3zzの精製はできたものの、他のダイマーは精製後の量は少なく、マルチマー形成のためには不十分であった。またTCRabダイマーもCD3ダイマー同様に、形成はできたが量的に不十分で、十分量を得るような改善に至らなかった。
全複合体再構成を成功させることはできなかったが、比較的多くダイマーとして精製できたCD3zzを含むリポソームを、CD3z欠損T細胞にin vitroで加えると、細胞表面のTCR発現が昂進し、抗TCR抗体の刺激に反応するようになったことから、形成したCD3zダイマーは機能的であることが証明された。
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