| 研究課題/領域番号 |
24240048
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
崎村 建司 新潟大学, 脳研究所, 教授 (40162325)
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| 研究分担者 |
阿部 学 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (10334674)
中務 胞 新潟大学, 脳研究所, 助教 (60641579)
夏目 里恵 新潟大学, 脳研究所, 技術職員 (60467082)
周 麗 新潟大学, 脳研究所, 研究員 (80568410)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 遺伝子改変動物 / ラット / ES細胞 / 異種間キメラ |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、脳機能解析及び病態解明に利用できる遺伝子改変ラットを安価かつ容易に作製する方法を確立し、ノックアウトマウスと同様な感覚でノックアウトラットを研究リソースとして利用できる基盤を作ることである。そのために、ラットES細胞の培養条件、相同組換えを用いた迅速な遺伝子改変方法、確実に生殖細胞への分化をするキメラ作製法を確立する。さらに、マウス・ラット異種間キメラを用いたラットES細胞由来生殖細胞（精子及び卵子）の作出法を開発することを計画して研究を進めてきた。
今年度は、すでに樹立しているSDラット及びBNラットES細胞から生殖系列遺伝するキメラ作製方法を確立するための基礎的な条件設定を進めてきた。NSE-VenusノックインラットES細胞株及びトランスジェニックラットES細胞株をラット胚に導入し、キメララットを作出した。これらキメララットから生殖系列遺伝をするものを得ることができた。すなわち、これまで樹立したSD系統由来ES細胞株は、多分可能を持っていることが証明できた。さらに、ラット胚盤胞をへラットESを導入して生殖系列キメラを作る基本的条件が明らかになった。さらに引き続きBNラットES細胞を注入したキメララットから生殖細胞へES細胞が分化する個体を検索する。
一方、ラット・マウス異種間キメラを用いてラットES細胞由来生殖細胞を得るプロジェクトに関しては、雌の生殖細胞形成能は正常であるが、雄の精子形成のみができないDmrt7遺伝子ノックアウトマウス胚へラットES細胞を導入したキメラマウスを作製してきたが、発生が途中で止まる物が多く、ラットES細胞由来精子は得られていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
すでに樹立しているSDラット及びBNラットES細胞株から生殖細胞及び全身で蛍光タンパク質を発現する細胞株を樹立し、その細胞株を利用して生殖系列遺伝するキメラ作製方法の開発を進めてきた。様々な条件を検討してきた結果、SDラット由来ES細胞株から生殖系列遺伝する方法を確立した。また、ラットES細胞における相同組換えによる遺伝子改変をおこなうために、その培養条件や、薬剤選択の詳細な条件検討を進めてきており、基本的な手法は確立できたと考えている。本研究で最も困難であると予想していた、生殖細胞へ分化するラットES細胞の多能性を保った状態での取り扱いが確立したことは、ラットES細胞を用いた遺伝子改変動物作製という本研究開発の目的の１つを達成できたと思っている。今後は、その手法の詳細を検討することで、安価かつ迅速に遺伝子改変ラットを作製するプロトコールが確立できると考えられる。
一方、異種間キメラによるラット生殖細胞の作出をはかるべく、生殖細胞形成不全のTifp39遺伝子ノックアウトマウスを樹立した。また、雌の生殖細胞形成能は正常であるが、雄の精子形成のみができないDmrt7遺伝子ノックアウトマウスを東北大学西森教授より分与を受け、その胚にラットES細胞を導入したキメラマウスを作製してきたが、未だ生殖細胞に分化したキメラマウスを獲るところまではいっていない。今後は、その仔細な条件を検討すると共に、受容胚の細胞性免疫についても検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回SDラット由来ES細胞を、有色であるDA系統及びBN系統とSD系統とのF1胚に導入したキメラ動物より生殖系列遺伝に成功した。この成果を基に、ラット・ラットキメラによる遺伝子改変動物の獲得に必要な基本的な条件を決定する。これまで報告されているES細胞を用いた遺伝子改変動物は、有色であるDA系統のラットES細胞をSD系統のラット胚に導入して樹立したものがほとんどである。我々はSD、BN、Wistar、DA系統それぞれからES細胞を樹立しているが、受容胚としてはどの様な系統の組み合わせが良いのかを検討する。また、ES細胞での組換え方法や細胞の凍結方法など、迅速かつ安価に実験が進められる条件の検討を進める。
ラット・マウスキメラに関しては、生殖細胞形成能がないTifp39遺伝子ノックアウト及び精子形成能がないDmrt7遺伝子ノックアウトマウスから胚採取用の雌マウスを多量に生産し、人工授精によりノックアウト胚を取得する。これら胚にNSE-VenusノックインラットES細胞株及び蛍光蛋白遺伝子トランスジェニックラットES細胞株をを導入し、ラット由来生殖細胞を持つキメラマウスの作製を試みる。
ラットES細胞での遺伝子改変を効率的に進める諸条件を検討する。とりわけ、遺伝子組換え体のスクリーニングをおこなう時に多数のクローンの凍結が必要であるが、その有効な方法が確立していない。ラットES細胞は分化しやすく、マウスES細胞でこれまで採用されてきた凍結手法ではうまくいかないことが明らかになっている。この問題を解消するために、道具を含めて新たな方法の開発をおこなう。
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