| 研究課題/領域番号 |
24240076
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
佐々木 克典 信州大学, 医学部, 教授 (30170666)
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| 研究分担者 |
阿部 康次 信州大学, 繊維学部, 教授 (00126658)
冨永 貴志 徳島文理大学, 薬学部, 准教授 (20344046)
岳 鳳鳴 信州大学, 医学部, 助教 (20532865)
池田 宇一 信州大学, 医学部, 教授 (30221063)
寺本 彰 信州大学, 繊維学部, 准教授 (40227525)
市川 比奈子 信州大学, 医学部附属病院, 講師〈特定雇用) (50609617)
柴 祐司 信州大学, 医学部, 助教 (70613503)
齋藤 直人 信州大学, 医学部, 教授 (80283258)
友常 大八郎 信州大学, 医学部, 助教 (80283802)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 多能性幹細胞 / 細胞のプロファイリング / 網羅的遺伝子解析 / ヒートマップ解析 / 主成分分析 / カーボンナノチューブ |
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| 研究概要 |
本研究では独自に開発した技術により多能性幹細胞のそれぞれの細胞株の特質をプロファイリングし、それらの特質を生かしながら最適な条件で再生医療に応用可能にすることを目的とする。
計画している具体的な研究開発は、①プロファイリングツール開発 1)未分化から分化への移行を識別する技術開発、2)分化を特定の方向に進める技術、3)特定の分化細胞への移行をライブで把握する技術開発、②プロファイリング指標を基盤にした総合評価による個々の細胞株のプロファイリングの確立である。
プロファイリングツール開発はプロファイリングを行うための指標を決定することを目的とする。今年度は、ヒトES細胞株4種類、ヒトiPS細胞2種類、対象として線維芽細胞、脂肪幹細胞を用い、株本来の遺伝子発現を網羅的に検索することを実施した。ヒートマップ解析ではKhES1とKhES2（グループA）、201B7と253G1（B）、KhES3とH1（C）、対照である脂肪幹細胞と線維芽細胞（D）はそれぞれ類似していた。さらにグループAとBは近い関係にあり、CはA、Bから離れているが、Dよりは近かった。この傾向は、一部スキャッタ―プロットにおいても示された。主成分分析を行うと、A､B、Cは対になって三次元空間に配置されたが、脂肪幹細胞と線維芽細胞はYZ面において対角の位置にあった。さらにBは線維芽細胞の高さ、Cは脂肪幹細胞の高さにあった。これらの内容と解釈は本年度開催される第11回国際幹細胞学会で報告する。さらに肝細胞がICGを選択的に取り込むことを利用して細胞を分取する方法を新たなツールとして確立した。この装置を用いて、肝細胞の成熟のレベル解析が可能になり、株間における内胚葉系の分化の違いを肝細胞を例として比較できるようになった。この研究の一部は第12回再生医療学会（再生医療12(suppl):287,2013)で発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は多能性幹細胞の細胞株をプロファイリングし、それぞれの細胞の特性を形として表現し、一見して細胞株の違いを判別できるようにすることが目的である。そのためには、それぞれの株を特徴づける指標を探し出さなければならない。さらに、それぞれの株の特質を抽出するためには、分化傾向も極めて重要な因子になる。
最初にエネルギーを注いだのは、未分化状態での株の特質の解析であった。そのため遺伝子の網羅的解析を行った。そのデータをさまざまな角度から、検討を加え、それぞれの株の特質、さらにプロファイリングの指標とするものを選び出すめどをつけた。したがって、この点では目的はほぼ達成した。
次に分化傾向を指標にしながら、特質を抽出する点に関しては、主に２年め以降の研究のテーマになるが、ツールの開発あるいは確立を初年度でいくつか行った。神経組織（外胚葉を象徴するものとして）で膜電位色素を用いて活動電位を見た。これは分化誘導させた組織ではなく、既存の神経組織で試してみたものであり、まだ目的は達していない。次に誘導肝細胞（内胚葉）にICGをとりこませながら、開発した細胞分画装置で、分化傾向を描出できるかどうかを検討した。これはきわめて有望であり、細胞の成熟の程度を解析できる興味深い結果を得ることができることが分かった。心筋細胞（中胚葉）については、収縮の動的解析と膜電位による色素の変化に焦点をあてる二本立てで解析を進めており、収縮の動的解析が少し進んでいる。また、新たな分化誘導技術に関しても、カーボンナノチューブを用いたもの、低分子化合物による膵外分泌細胞の分化誘導などにも成功した。以上の結果からおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
24年度は未分化状態をプロファイリングすることを目的に網羅的遺伝子発現解析を行った。今後、これらの結果を基盤にして、適切な指標の抽出と定量化を行う。さらに、分化への移行に関する指標を明確にし、プロファイリングを進める。具体的に以下の研究開発を実施する。
①プロファイリングツール開発する （１）未分化から分化への移行を識別する技術開発１）ライブで分化移行を識別する技術開発 外胚葉系の細胞の分化移行に焦点をあて、指標の定量化を実施する。２）未分化メカニズム解明による指標の妥当性および新たな指標の創出 24年度はヒトES細胞4株とヒトiPS細胞2株を用いて、Nestin発現を指標に未分化状態の安定性と分化傾向をDNAチップで検討した。今後これらの結果を定量的PCR法とChip法によりポリコーム遺伝子、エピジェネティック因子の挙動と関連付け、分化傾向を評価し、プロファイリングの新たな指標を決定する。（２）分化を特定の方向に進める技術 24年度はカーボンナノチューブによる骨芽細胞分化誘導、低分子化合物による肝細胞分化を新たに加え遺伝子解析を行った。今後ヒトES細胞4株、iPS細胞2株から作成した胚様体および分化誘導した細胞の遺伝子発現および代謝を網羅的に解析し、プロファイリングの指標を抽出する。（３）特定の分化細胞への移行をライブで把握する技術開発 １）分化神経細胞の評価 膜電位感受性色素を用いて分化した細胞の特徴を識別する。２）分化心筋細胞の評価 収縮力をコンピュター解析し、定量化を行う。３）分化肝細胞の評価 24年度は購入した装置により、分化したICG細胞の割合を比較した。今後ICG陽性細胞を分取し、分化肝細胞の分化のレベルを遺伝子発現により評価し、プロファイリングの定量的指標を確定する。
②プロファイリング指標を基盤にした総合評価による個々の細胞株のプロファイリングを確立する。
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