研究課題
１．ヌクレオチド除去修復促進因子の解析昨年度までに6種類の精製組換えタンパク質因子（XPC、TFIIH、XPA、RPA、ERCC1-XPF、XPG）を用いた再構成ヌクレオチド除去修復（NER）反応を促進する因子として、プロテインキナーゼを同定した。無細胞リン酸化反応により、このリン酸化の主要な標的としてXPC、TFIIH、XPGの3種類を同定した。さらに、組換えXPC、XPGタンパク質を脱リン酸化処理すると（6-4）光産物を基質とする再構成NER反応の効率が有意に低下したことから、これらのタンパク質のリン酸化がNERに対して促進効果を示すことが強く示唆された。一方、紫外線による主要なDNA損傷であるシクロブタン型ピリミジン二量体（CPD）の5'側に脱塩基部位を挿入することにより、上記の精製タンパク質による無細胞系でのCPDの切り出し活性が促進されることが確かめられた。現在、細胞内におけるNER活性に対する脱塩基部位の効果を検討している。２．一分子イメージングによる損傷認識機構の解析これまでに、量子ドットで蛍光標識したXPCタンパク質複合体とλファージDNAを用いた一分子観察系の構築を行った。今回は非損傷DNAの両端を基板上に固定し、そこに蛍光標識XPCを添加してその挙動をリアルタイム観察した。その結果、XPC複合体がλファージDNA上を一次元自由拡散する様子が観察され、求められた拡散係数からXPC複合体がDNA上をhopping、およびscanningすることにより、効率良く損傷部位を認識していることが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
昨年度までに無細胞NER反応を促進する因子として同定したプロテインキナーゼの標的タンパク質を実際に同定し、それらの因子のリン酸化が実際にNER反応に対して促進的に働くことが確かめられた。今後、リン酸化部位の同定、変異体作成と細胞レベルでの機能異常解析を進めることにより重要な知見が得られると期待される。また、生体内においてNERによる修復効率が低いCPDの修復が、近傍の脱塩基部位により促進されるという当初のモデルが、少なくとも無細胞系では正しいことを確認できた。一分子解析では、非損傷DNA上でのXPCタンパク質複合体の動態を観察することに成功しており、全体として研究は概ね順調に進展している。
１．ヌクレオチド除去修復促進因子の解析NER反応の促進に関わるXPC、XPGタンパク質のリン酸化部位を同定し、そのアミノ酸に変異（非リン酸化体、リン酸化ミミック体）を導入して無細胞系、および細胞内におけるNER反応に対する影響を調べる。これらのタンパク質のリン酸化がNERを制御するメカニズムを、DNAや他のNERタンパク質との相互作用に着目して解析するほか、細胞のDNA損傷応答やシグナル伝達への影響についても調べる予定である。一方、細胞内で人為的に脱塩基部位の蓄積を引き起こした状態で紫外線を照射し、CPDの修復効率に対する影響を評価するほか、XPCやDDB2を染色体上の特定の領域にテザリングさせ、局所的なNER活性の促進が見られるかどうかを検討する。２．一分子イメージングによる損傷認識機構の解析非損傷λファージDNA上のXPC複合体の挙動について、より詳細な解析を進めるとともに、部位特異的にDNA損傷を組み込んだλファージベクターを利用して観察を行い、XPCが損傷部位に到達する瞬間を捉えることを目指す。さらにXPCと協調して紫外線損傷の認識にあたるDDB2についても量子ドット標識するための組換えタンパク質作成を完了しており、同様の観察を試みることでXPCとの損傷認識様式を比較検討する。
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Development
巻: 141 ページ: 269-280
10.1242/dev.099622.
Journal of Biological Chemistry
巻: 288 ページ: 10936-10947
10.1074/jbc.M112.444026.
Nucleic Acids Research
巻: 41 ページ: 6917-6929
10.1093/nar/gkt434.
Cancer Research
巻: 73 ページ: 4362-4371
10.1158/0008-5472.CAN-12-3154.
Journal of Molecular Recognition
巻: 26 ページ: 653-661
10.1002/jmr.2308.
http://www.research.kobe-u.ac.jp/brce-sugasawa/
