| 研究課題/領域番号 |
24241064
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
竹田 潤二 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50163407)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 疾患関連遺伝子 / ヒトiPS細胞 |
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| 研究実績の概要 |
交配を介さずに片アレル遺伝子変異から両アレル遺伝子変異への変換を効率よく行うシステムをマウスＥＳ細胞で樹立したので、この原理をヒトiPS細胞に応用し、ヒトゲノムに潜んでいる疾患関連遺伝子を交配することなしに、両アレル変異体に交換することを目標に実験を行った。
(1) ヒトiPS細胞のブルーム遺伝子改変による両アレル変異導入可能細胞への変換
H25年度にTetカセット自体の改変を行い、そのカセットをブルーム遺伝子に挿入した。最初にTetカセットの挿入効果を確認するためにドキシサイクリン非添加時のブルーム遺伝子の発現を調べたところ正常であることが判明した。旧Tetカセットは、ドキシサイクリン非添加時においてもブルーム遺伝子の発現が低下したので、新しいTetカセットの方が有利であることが証明された。さらにドキシサイクリン添加したところ、ブルーム遺伝子の発現が低下していることが判明した。 なお、化学物質によるブルームタンパク質活性の検討実験であるが、化学物質添加において細胞増殖が影響受けたので、化学物質の濃度を含め検討中である。
(2)ゲノムに内蔵する劣勢変異のホモ接合体化のモデル実験
片アレルのAAV遺伝子座に薬剤選択カセットを挿入し、ホモ接合体化するかどうかを確認したところ、そのようなクローンが獲得できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1) ヒトiPS細胞のブルーム遺伝子改変による両アレル変異導入可能細胞への変換
H25年度にTetカセット自体の改変を行い、そのカセットをブルーム遺伝子に挿入した。最初にTetカセットの挿入効果を確認するためにドキシサイクリン非添加時のブルーム遺伝子の発現を調べたところ正常であることが判明した。旧Tetカセットは、ドキシサイクリン非添加時においてもブルーム遺伝子の発現が低下したので、新しいTetカセットの方が有利であることが証明された。さらにドキシサイクリン添加したところ、ブルーム遺伝子の発現が低下していることが判明した。
(2)ゲノムに内蔵する劣勢変異のホモ接合体化のモデル実験
片アレルのAAV遺伝子座に薬剤選択カセットを挿入し、ホモ接合体化するかどうかを確認したところ、そのようなクローンが獲得できた。
以上の結果は、ゲノムに内蔵する劣勢変異をホモ接合体化し、表現型解析するための優れたシステムであると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) ゲノムに内蔵する劣勢変異をホモ接合体化への変換の効率の検討
モデル実験で片アレル変異から両アレル変異体へ変換したクローンが得られたが、その頻度の検討がなされていないので、頻度を測定する。
(2) 表現型解析
ヒトiPS細胞が未分化のまま存在できないような表現型について検討していく。
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