| 研究課題/領域番号 |
24247030
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
片岡 幹雄 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 教授 (30150254)
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| 研究分担者 |
上久保 裕生 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 准教授 (20311128)
山崎 洋一 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 助教 (40332770)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | イェロープロテイン / 低障壁水素結合 / 時間分割ラウエ法 / 光反応 / アルギニン / チロシンのpKa / NMR / キメラタンパク質 |
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| 研究概要 |
生物が共通の構造基盤から多様性を獲得する分子機構を、イェロープロテインを材料に明らかにしようとする目的で本研究は進められている。本年度は、特に共通の構造基盤として、H. halophilaのイェロープロテインの構造解析を中心に進めた。
われわれの発見した発色団とE46の間の低障壁水素結合について、溶液中でも実際に形成されているかどうかを調べた。理論計算により、R52が脱プロトン化しているときにのみ低障壁水素結合が形成される可能性のあることが分かったため、R52のプロトン化状態を詳細に検討した。野生型には、発色団周囲に２つのプロトン化部位があるがR52Qでは１つしかない。吸収スペクトルや光反応は両者で大きく異ならないことから、野生型のプロトン化部位は発色団とR52であり、生理的条件下ではR52が脱プロトン化していることが示唆された。
光反応に伴う構造変化を100ピコ秒時間分解能の時分割ラウエ構造解析により明らかにした。その結果、光照射後100ピコ秒以内に形成される初期中間体では、発色団がトランスとシスの中間の90°捻じれた遷移状態の構造を形成していることが明らかになった。タンパク質中で遷移状態の構造が安定化されることを示した世界で初めての例である。また、発色団とE46の水素結合距離の変化も詳細に理解され、初期中間体で低障壁水素結合が解消していることが示された。
また、イェロープロテイン中のすべてのチロシン残基のpKaをNMRにより求めた。その結果、チロシンには三種類の存在状態の違いがあり、発色団と水素結合しているY42のpKaは異常に高いことがわかった。
R. capsulatusのイェロープロテインは、H. halophilaのイェロープロテインと比べて光反応時間が1,000倍以上遅い。両者のキメラタンパクを作成し、光反応時間を制御していると思われる領域が同定された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
低障壁水素結合の存在の証明は、中性子結晶構造解析だけによっていたが、pH滴定やFTIRによりその存在を検証できる可能性を示した。また、当初予定していなかった理論計算により、低障壁水素結合の形成条件が示されたため、その検証が格段に進んだ。
時間分解ラウエ構造解析により、タンパク質の時間分解結晶構造解析ではこれまで実現されていなかった100ピコ秒という速い分解能が実現でき、また4つの光反応中間体の構造が1.65A分解能で解析された。これらは、タンパク質では世界で初めての成果である。この解析は、データ収集に2年、解析に1年を予測していたがわれわれの調整した結晶がきわめて良質であったことから、高精度のデータが短期間で得られたことによる。
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| 今後の研究の推進方策 |
時間分解ラウエ解析は、今年度以降いくつかの変異体に対して適用する予定である。これにより、低障壁水素結合の生理的役割が明らかになると期待している。また、この方法を溶液散乱に応用することにより、溶液中での構造変化も研究していきたい。時間分解溶液散乱は、今秋以降に実験ができるよう現在準備を進めている。
変異体の中性子結晶構造解析を行い、低障壁水素結合形成の要因を明らかにする。結晶化はすんでおり、中性子回折実験の再開を待っている状態である。中性子結晶構造解析は、日本のJRR3のBIX4が最も性能がよく、欧米の回折計では代替ができない、または代替できても十分な実験時間を確保できないため、解析可能なデータ収集には問題がある。また、NMRやFTIRを用いて、R52のプロトン化状態と低障壁水素結合の形成の関係を明らかにしていく。そのための試料調整や実験条件整備を進める。
多様性の獲得機構に関しては、R. capsulatusのイェロープロテイン、R. sphaeroidesのイェロープロテインーフィトクロム融合タンパク質のイェロープロテインドメインを用いた比較研究を進める。結晶構造解析のための結晶化の条件探索を行っている。いまだに有望な条件が見つからないが、これまでの経験から乗り越えられると考えている。結晶化ができれば、結晶構造解析、H. halophilaのイェロープロテインとの比較研究と進める。一方、キメラタンパク質を利用し、光反応時間を制御する領域や吸収スペクトルを制御する領域を同定する。キメラタンパク質のDNAは作製済みである。領域が明らかになれば、その領域内での部位特異的置換により、関係するアミノ酸を明らかにしたい。多様性を獲得する分子機構に迫ることができると期待している。
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