| 研究課題/領域番号 |
24247030
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
片岡 幹雄 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 教授 (30150254)
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| 研究分担者 |
上久保 裕生 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 准教授 (20311128)
山崎 洋一 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 助教 (40332770)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | イェロープロテイン / 低障壁水素結合 / 光反応 / 結晶構造解析 / アルギニン / ＦＴＩＲ / キメラ蛋白質 / 国際情報交換（アメリカ、デンマーク） |
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| 研究実績の概要 |
水溶性の光受容蛋白質、イェロープロテイン（PYP）、を用いて、共通の構造基盤から機能や光反応の多様性を生み出す分子機構を明らかにすることを目的としている。光反応時間が大きく異なるhPYP、RcPYP、存在形態の異なるPprPYPについて研究を進めた。
前年度、RcPYPについて結晶構造解析に成功した。結晶化には界面活性剤が必要であるため、水溶液中でスペクトルに対する界面活性剤の影響を測定した。結晶中では、長波長シフトするが、溶液中では短波長シフトすることが明らかになった。結晶のスペクトルは、活性中間体に標的蛋白質が結合した際のスペクトルに類似しているが、溶液中ではむしろ光反応途上のスペクトルに類似している。光反応による構造変化と類似の変化を界面活性剤がもたらし、結晶化するときにさらに界面活性剤が特異的に結合すると推測している。hPYPでも同様の測定を進める予定である。
hPYP野生型およびR52Q変異体のN15ラベル体を作製し、光反応に伴うFTIRスペクトル変化を詳細に調べた。その結果、中性子結晶構造解析により脱プロトン化していると結論したR52は、L中間体でプロトン化することが明らかになった。暗状態のスペクトルの同位体効果は、プロトン化したアルギニンでは説明ができず、脱プロトン化していると解釈される。理論計算を含めさらに詳細に検討を進める。
全長のPprの光反応の測定から、PYPドメインが光反応した場合に、Bphドメインの光反応が抑制されることが示された。また、このときドメイン配置に変化が起きていることが示唆された。hPYPの活性中間体の構造やRcPYPの構造との比較研究から、情報の伝播機構の理解につなげたい。
hPYPとRcPYPのキメラ蛋白質を用いた研究より、吸収スペクトルを制御する領域のひとつが同定された。多様性を生むメカニズムの解析に進展している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
R52のプロトン化状態のFTIRによる研究が進み、最初の光反応中間体であるＬ中間体において、R52がプロトン化することが明らかになった。基底状態でのFTIRスペクトルは、R52がプロトン化していると仮定すると、説明できないことも明らかになった。理論からの批判に耐えうる実験的証拠がそろってきている。
RcPYPの結晶構造解析から、hPYPとの違いを生む部位が明確になり、共通の構造基盤から多様性を生む分子機構の一端が解明されている。これは、キメラ蛋白質を用いた研究からも裏付けられている。
全長のPprの研究が進み、PYPで受容した光情報が下流に伝播する機構の理解につながっている。
一定の成果を得てきた時間分解結晶構造解析では、変異型に応用しようとしているが、変異型の結晶は光反応に弱く、低温実験を可能にするなど、現在実験系に工夫を加えているところである。
以上のように、共通性と個性（多様性）に着目した研究が順調に進捗しており、国内外の学会で口頭およびポスター発表を行い、高い評価を得ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画に沿って順調に研究が進展しているので、今後も研究計画に沿って研究を進めていく。時間分解結晶構造解析に関しては、終了時までにE46QあるいはR52Q変異型について、データ収集から解析まで行いたいと考えている。FTIRおよびNMRを駆使して低障壁水素結合および脱プロトン化したR52の実験的証明を行う。否定的な理論計算があるが、計算と実験の齟齬の原因を明らかにし、PYP光反応の分子機構の全貌を解明したい。
hPYPでは、光反応に伴いN端のアンフォールディングを含む構造変化が起き、この変化を標的蛋白質が認識すると考えられるが、他の二つではこのような大きな変化が起きないことが明らかになってきている。にもかかわらず、情報が伝達される。この事実に多様性の生じるヒントがあると考えている。光反応機構の比較研究を詳細に行い、違いを生む領域の同定に全力を挙げる。
最終年度であるため、特に多様性獲得の分子機構に焦点を定めてまとめるよう努力する。
先進的な結果が得られているため、学会で積極的に発表するとともに、投稿論文としてまとめることにも力を注ぐ。
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