研究課題
シロイヌナズナ、イネにおけるミトコンドリアゲノム上の遺伝子破壊ターゲットについて、それぞれ複数の人工制限酵素を作製し、植物用形質転換ベクターを作製した。これらについては既に植物核ゲノムに導入した形質転換植物がT2ラインまで進んだ種子が得られており、今後ミトコンドリアゲノム上に変異が導入されているか否かを検討していく予定である。また、ここまでで作った二つ一組の人工制限酵素ORFが同時に発現しミトコンドリアへ局在する植物形質転換ベクターについて、その機能（遺伝子の同時発現とミトコンドリアへの局在）を確認検証した。上記ベクターのORFの部分にGFPやRFPの遺伝子配列を導入した同様のベクターを作製し、パーティクルガン法を用いて植物緑葉へ形質転換導入し、その遺伝子発現と局在を蛍光顕微鏡観察によって検証を行った。その結果、これらのベクターでは、二つのORFは、（遺伝子発現したものについてはきちんとミトコンドリアへ局在していることは確認できたが、）二つの遺伝子が同時に発現しない場合があることや、発現量に大きな差がある場合があることが確認された。そのため、植物形質転換用のベクターを改変し、別の種類の薬剤誘導型プロモーターや恒常的な発現用のプロモーターの使用や、発現量を増やしサイレンシングを抑制するようなターミネーター配列を導入したベクターを作り直した。これらの改変ベクターでは、二つ一組の人工制限酵素が同時に恒常的に強く発現し、またミトコンドリアへ局在することが確認された。また、新たなベクターに関してリクローニングを行い、出来たものからシロイヌナズナへ形質転換を行っている。
2: おおむね順調に進展している
当初予定通り、ミトコンドリアゲノム上の複数の遺伝子破壊ターゲットに対応するそれぞれ複数の人工制限酵素配列について、植物内で誘導発現もしくは恒常的に発現するベクターが作製進んでおり、またこれらを用いた核ゲノム形質転換植物も順調に作出出来つつある。上述したとおり、これらの中には二つの人工制限酵素ペアのうち片方の発現が著しく弱かったり発現しなかったりしたものもあったが、そのベクターについて、プロモーター配列やターミネーター配列の改変によって、大幅に発現を改良することができた。これら改変型のベクターを用いて順次人工制限酵素ペアの植物発現プラスミド作りをすすめている。ここまで行ってきた、複雑困難だったベクター作製が終了に近づいており、ここからは通常行っている形質転換のルーチン作業によって、たくさんの植物材料が得られてくると考えており、おおむね予想通りのペースで研究が進展していると考えている。
前年度までで作製してきた人工制限酵素ベクターと、これを導入した形質転換植物について、実際にミトコンドリアゲノムの改変が起こっているかどうかを検証していく。基本的にはミトコンドリアゲノム上の遺伝子をターゲットとしているが、表現型（生育虚弱性）はあまり現れないような破壊対象を選んでいる。そのため、各形質転換植物の後代複数の植物体それぞれについてCel-1assayやシークエンス解析などによって遺伝子型を確認する予定である。一つずつの植物についてDNA解析を行うのでは時間と資金がかかりすぎる為、5個体ずつ等にまとめてDNA抽出と検定を行って、該当するミトコンドリアゲノム破壊株を選抜する予定である。ミトコンドリアゲノムは、細胞あたり数百コピーあるといわれている超多倍数体状態となっている。このため、この中のいくつかのコピーが破壊されただけでは変異が固定されず、遺伝子破壊の初期はヘテロプラスミーと呼ばれる正常型と異常型のゲノムが混在した形で植物が存在すると思われる。人工制限酵素はかなり多く発現するようにベクターを改良してきており、またその活性がある限り対象遺伝子が切断され続けるため、異常型遺伝子が結果として優勢になると考えている。また、形質転換当代を用いるのでは無く、後代を用いることで、ある程度分離が起こり、異常型としてホモプラスミー化された個体を得ることが可能であると考えている。
すべて 2014 2013
すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件)
ANNALS OF BOTANY
巻: 113 ページ: 851-859
10.1093/aob/mct305
PLANT AND CELL PHYSIOLOGY
巻: 55 ページ: 30-41
10.1093/pcp/pct150
PLANT CELL REPORTS
巻: 32 ページ: 1743-1750
10.1007/s00299-013-1487-1
巻: 54 ページ: 750-765
10.1093/pcp/pct029
