| 研究課題/領域番号 |
24248016
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
依田 幸司 東京大学, 農学生命科学研究科, 教授 (20143406)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 微生物 / 酵母細胞壁 |
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| 研究概要 |
未だに機構が明らかでないβ-1,6-グルカン合成には、小胞体の可溶性タンパク質Kre5と膜タンパク質Keg1、小胞体と出芽部位の細胞質膜に存在する膜タンパク質Kre6、細胞膜局在が予想されるGPI-アンカー型タンパク質Kre1、分泌シグナルを持つKre9が重要な働きをしており、各々について詳細な解析を進めている。
タグで標識していない内在タンパク質を検出する抗体作製を試みてきたが、既に取得済みのKre6以外の抗原調製は難航していた。今年度前半はピキア酵母発現系を様々な形で試みたが、成功しなかった。やむをえず、Kre9については大腸菌の封入体タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルで分画して切り出したものを、Kre5については酵母細胞質中に生産させたものを精製して抗原とし、ウサギを免疫した。できた抗血清は力価と特異性が十分でないので、今後、アフィニティ精製して使用する予定である。
昨年度作製に成功した、機能を保持したC末端HAタグ標識Kre9は、間接免疫蛍光染色により主に小胞体様の像として認められた。今年度は、蔗糖密度勾配遠心分画で小胞体への局在を確認するとともに、出芽中の芽にも著量存在していることを見出した。芽への局在は、Kre6でその機能に必須なことを明らかにしていたので、Kre9とKre6の関係について調べた。Triton X-100により可溶化した酵母溶菌液からの免疫沈降で、Kre9-3HAとKre6は相互作用していることが明らかになった。Kre6にはリン酸化修飾を受けたものと受けていないものが存在するが、Kre9-3HAと免疫吸着で一緒に回収されるのは、非リン酸化型が大部分であった。β-1,6-グルカンがほとんど作られなくなるkre9破壊株を調べると、Kre6のリン酸化はほとんど起きておらず、また免疫染色像では出芽した芽におけるシグナルが認められなくなっていた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
理想的な形ではないが抗原タンパク質を調製し、力価と特異性に問題はあるものの抗血清作製までは達成した。今後のアフィニティ精製により、細胞内在のKreタンパク質を検出する系をを確立できるようになったと考えられる。
過剰発現株の解析から、培地中に分泌されると報告されていたKre9が、小胞体や出芽した芽に検出されたのは先行研究を覆す重要な発見である。さらに、糖代謝酵素のモチーフを持つKre6とKre9が相互作用することも明らかになった。Kre6が芽に局在することはβ-1,6-グルカン合成に必須だが、kre9破壊株でこの局在がみられなくなることも分り、今後の解析による飛躍的発展が期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の最大の収穫であるKre9とKre6の物理的、機能的な相互作用について、さらに詳しく調べ、生化学的・細胞生物学的な意義を明らかにする。本年度はあまり進展が見られなかったKre1について、抗体の調製、各種変異株の作製と変異形質の解析を進める。
酵母細胞にはマンノシダーゼ消化に耐性でグルカナーゼに感受性のオリゴ糖鎖が存在することが報告されており、細胞壁糖鎖の合成との関連が示唆されている。このことについて再現性を調べ、当研究室でも解析できる系を確立した。予備的な検討では、これまで取得したkre変異株の細胞では野生株とオリゴ糖鎖の組成に差があるように見られ、今後詳細に調べる予定である。
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