| 研究課題/領域番号 |
24300139
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| 研究機関 | 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター |
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研究代表者 |
沼川 忠広 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 疾病研究第3部, 室長 (40425690)
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| 研究分担者 |
伊丹 千晶 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (90392430)
千葉 秀一 武蔵野大学, 付置研究所, 助教 (00510380)
長谷 都 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (20450611)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 脳神経疾患 / 神経科学 / 細胞・組織 / ストレス / 神経栄養因子 |
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| 研究概要 |
グルココルチコイドはストレスステロイドであり、HPA内分泌系(視床下部―下垂体―副腎皮質)の活性による血中濃度のコントロールがなされている。うつ病では、慢性的なストレスによりこのHPA系が亢進し、グルココルチコイドの濃度上昇が観察され、脳に悪影響を及ぼしているとされる。我々は、このグルココルチコイドストレス曝露後、グルココルチコイド受容体GRの発現低下に伴う脳由来神経栄養因子BDNFの機能低下を、細胞、および動物個体レベルで報告した(Numakawa et al., Neuroscience, 2013ほか)。そこで、本研究では、GR機能の促進による神経機能の向上に着目した。本年度の前半、脳の海馬および大脳皮質領域に特異的なCaMKIIプロモーターを用いて、GRのトランスジェニックラット(GR-Tgラット)の作成を試みた。ラットCaMKII-GRプラスミドによる培養ニューロンレベルでの過剰発現を確認した。しかし、このコンストラクトを用いた場合、受精卵のインジェクションによる陽性ファウンダーラットの創出ができなかった。そこで、今年度後半、新たにマウスCaMKII-GRプラスミドを作成し、Tgマウスの確立を目指した。その結果、3系統の陽性F1マウスを得ることに成功した。
Tgマウス樹立と並行して、培養大脳皮質ニューロンを用いたGR機能の増加を目的としたin vitro解析を網羅的に進めた。繊維芽細胞増殖因子によるBDNF機能促進は、グルタミン酸放出の増強などで確かめられ、BDNF受容体の発現や機能に変化を与えずに、下流シグナルPLCgamma強化のメカニズムなどが明らかとなってきた(論文準備中)。また、ステロイド様作用が知られるフラボノイドが、ホスファターゼshp2の活性化を介して細胞を保護することなどを報告した(Am. J. Chin. Med., 2014)
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度の前半では、グルココルチコイド受容体GRの大脳皮質特異的な強制発現動物としてラットの作成を目標とした。これは、培養下においてのGRの機能増強に伴うBDNF依存的な神経機能促進作用の解析では、ラットの大脳皮質領域より採取培養したニューロンを用いた実験を積み重ねてきたためである。しかし、ラット由来のCaMKIIプロモーター依存的なGR発現を想定したTGラット作成では、種や技術的な問題が関係するのか、トランスジーンの陽性ファウンダーラットを得ることができず、その結果としてTGマウス作成への変更を行うことにした。現在、3系統の陽性F1マウスを得ることに成功しており、今後、それぞれの系統におけるGR遺伝子の発現状況などの情報を得るための基礎的な解析等を行った後に、実験に必要な数の安定した産出を目指す。また、in vitroでの解析では、繊維芽細胞増殖因子などによるGR機能の増加メカニズムに関する基礎的なデータの集積を計画通り進めており、動物個体レベルでの実験結果との整合性が得られた場合には、大きな成果報告ができる可能性がある。全体的に、当初の計画通り、大脳皮質でGRの強制発現を目的とした動物の確立も順調に進んでいると考えられ、今後、in vitroでの検証に加え、動物個体レベルでの行動試験などを行い、グルココルチコイドストレス、GR機能の変化とBDNF機能、そしてうつ様行動の相互的な関係における分子的情報を得ることを目標としたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
26年度および27年度の研究計画後半において、in vitroの系を用い、GR機能増加作用が誘導するBDNF依存的な神経伝達機能の促進における分子メカニズムの詳細を精査し、一方で、確立したGR-TGマウスの脳内の分子動態のモニターに加え、その行動様式を網羅的に解析する予定である。In vitroの解析の結果得られた神経機能増強に関する基礎的知見が、GRを強制発現した個体レベルにどれだけ反映されるかは興味深い。TGマウスの系統の安定化後、実際の大脳皮質領域におけるGR蛋白質発現の様子を確認し、もうひとつのグルココルチコイド受容体であるmineralocorticoid受容体MRの発現や、BDNF受容体TrkBの発現または活性化状態への影響などを詳しく解析する。脳の領域特異性が実現されるので、見出された大脳皮質特異的なシナプス機能やBDNF関連分子の発現および活性化の質的変化と、個体レベルでの行動変化の関連性を考察し、このTGマウスの精神疾患の病態研究における有用性を検証する。
また、一部のフラボノイドは、ステロイド様作用や、BDNFシグナルの活性化作用などが示唆されていることから、既に確立されている抗うつ薬に加え、フラボノイド類などを培養ニューロンやwild動物へ投与してその効果を網羅的に解析したい。そして、新たに得たTGマウスの行動およびストレス負荷に対する抵抗性などとの比較検討を行いたい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
培養下でのグルココルチコイド受容体GRの機能解析では、ラット由来の大脳皮質ニューロンを用いてデータを収集してきた。そのため、最近ようやく報告がなされ始めたTGラットの作成は魅力的であったため専門業者に受託注文し作出を試みた。その結果、より実績あるTgマウス作成に比べて種の問題からか、遺伝子改変動物が生まれてこない状況となった。そこでTGマウス作成へ遺伝子コンストラクト構築からの変更を行った。その結果、GRを強制発現するTGのF1マウスは誕生したが、25年度内での施設への搬入等は物理的に無理であった。このため、次年度に遺伝子改変マウス作成に要した費用等を支払う必要が生じたため。
搬入するTGマウスは現在3系統存在し、動物作出の必要経費に加えて、それぞれのマウスにおける遺伝子情報の基礎的解析等に相応の費用が必要となる。また、TGマウスを利用した動物行動試験等が可能になるまで、主としてラットより作成した培養ニューロンによるin vitroでの解析を精力的に進めるが、bFGFなどの神経栄養因子、抗体、および阻害剤など生化学的実験に用いる試薬の購入費が必要である。また、網羅的な解析を効率よく進めるための研究補助員への給与は重要である。さらに、成果は積極的に発表するため、関連学会への参加や、英文原著としての出版費等が必要である。
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