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2014 年度 実績報告書

Hcn4ノックインマウスを使ったバイオペースメーカー細胞の高効率スクリーニング

研究課題

研究課題/領域番号 24300145
研究機関久留米大学

研究代表者

鷹野 誠  久留米大学, 医学部, 教授 (30236252)

研究分担者 伊藤 政之  久留米大学, 医学部, 助教 (20442535)
武谷 三恵  久留米大学, 医学部, 助教 (30289433)
研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2016-03-31
キーワードバイオペースメーカー / HCN4 / 洞房結節 / 転写因子
研究実績の概要

【昨年度までの研究実績の概要】完全房室ブロックや洞機能不全症候群などの徐脈性不整脈の新しい治療法として、バイオペースメーカー細胞が注目されている。我々は洞房結節ペースメーカー細胞の分子マーカーであるHCN4チャネルに注目し、HCN4遺伝子座にルシフェラーゼ遺伝子をノックインしたマウス(HCN4+/Luc)を作成することに成功した。さらにHCN4+/Lucマウスから採取した脳・脊髄・洞房結節標本を使ってHCN4発現部位を可視化できることを実証した。

【本年度の研究実績の概要】HCN4+/Lucマウス胎児から線維芽細胞を培養し、iPS細胞の作成を試みたが、形質転換の効率が不十分であった。そこでnanogプロモータでpuromycin耐性遺伝子を発現させるトランスジェニックマウスとHCN4+/Lucを交配し、その胎児から線維芽細胞を培養し、puromycin耐性iPS細胞を作成する準備を行った。
これと平行してHCN4+/Luc新生児の心臓を酵素処理し、磁気標識した抗体を使って線維芽細胞を分離し、心筋細胞を純化して培養した。この心筋細胞に洞房結節特異的転写因子tbx3をレンチウイルスベクターにより遺伝子導入したが、ルシフェラーゼ化学発光を誘導することはできなかった。すなわち海外の研究室から報告された心筋直接再プログラミング法(Nat Biotechnol 2013;31:54-62)は、再現性が極めて低いと結論した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

バイオペースメーカー細胞を分化誘導するために、HCN4遺伝子座にルシフェラーゼをノックインしたiPS細胞、培養心筋細胞、線維芽細胞の三種類のソースを準備することが完了したため。

今後の研究の推進方策

tbx3に引き続き、洞房結節特異的転写因子をサブクローニングしたレンチウイルスベクターを順次作成する。これをiPS細胞、培養心筋細胞、線維芽細胞に遺伝子導入する。HCN4遺伝子座にノックインしたルシフェラーゼが発現誘導されるならば、その化学発光を定量的に測定できるので、もっともHCN4発現誘導効率の高い転写因子の組み合わせを決定する。

次年度使用額が生じた理由

想定以上に線維芽細胞からiPS細胞への形質転換効率が悪かった。そこで未分化性マーカーであるnanog遺伝子座にpuromycin耐性遺伝子をノックインしたマウスとHCN4+/Lucマウスとを交配し、puromin耐性iPS細胞を作成する準備が必要となった。そのため当初の計画通りに心筋分化誘導実験を平成26年度内に開始することが出来なかった。平成26年度に購入を予定していた心筋分化誘導用の試薬等には使用期限があるため、購入を延期せざるを得なかった。

次年度使用額の使用計画

平成26年度に購入予定であった心筋分化誘導用の試薬・消耗品の購入、遺伝子改変マウスの飼育延長にかかわる経費(飼料等)のために使用する。

  • 研究成果

    (16件)

すべて 2015 2014 その他

すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (7件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Ectopic automaticity induced in ventricular myocytes by transgenic overexpression of HCN2.2015

    • 著者名/発表者名
      Oshita K, Itoh M, Hirashima S, Kuwabara Y, Ishihara K, Kuwahara K, Nakao K, Kimura T, Nakamura K, Ushijima K, Takano M.
    • 雑誌名

      Journal of Molecular and Cellular Cardiology

      巻: 80 ページ: 81-89

    • DOI

      10.1016/j.yjmcc.2014.12.019

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Mechanism of the complete block of the Kir2.1 inward rectifier K+ channel under the external K+-free condition.2015

    • 著者名/発表者名
      Yanagi-Ishihara K, Itoh M, Takano M
    • 雑誌名

      The Journal of Physiological Sciences

      巻: 65 ページ: S118

  • [雑誌論文] Zdhhc3/7, the members of protein-palmitoylation enzymes, inhibit the current amplitude of HCN2 channel.2015

    • 著者名/発表者名
      Itoh M, Ishihara K, Takano M
    • 雑誌名

      The Journal of Physiological Sciences

      巻: 65 ページ: S118

  • [雑誌論文] Luminescence imaging of HCN4 expression and phenotypic analysis of HCN4 TET-off mouse.2015

    • 著者名/発表者名
      Kozasa Y, Ohshita K, Nakashima N, Ushijima K, Takano M
    • 雑誌名

      The Journal of Physiological Sciences

      巻: 65 ページ: S211

  • [雑誌論文] Epithelium-dependent periodical excitation in response to stretch of guinea pig seminal vesicle.2015

    • 著者名/発表者名
      Takeya M, Hayashi T, Nakamura K, Takano M
    • 雑誌名

      The Journal of Physiological Sciences

      巻: 65 ページ: S223

  • [雑誌論文] 過分極誘発陽イオンチャネル(HCN2)の潜在的な催不整脈性.2014

    • 著者名/発表者名
      大下健輔, 伊藤政之, 井形幸代, 桒原佳宏, 桑原宏一郎, 牛島一男, 鷹野 誠
    • 雑誌名

      日本生理学雑誌

      巻: 76 ページ: 83

  • [雑誌論文] QT短縮症候群に同定されたK チャネル変異の電気生理学的特性と臨床像.2014

    • 著者名/発表者名
      ダニエル・トシオ・ハーレル, 芦原貴司, 冨永伊知子, 阿部圭祐, 石川泰輔, 住友直方, 鵜野起久也, 鷹野 誠, 蒔田直昌
    • 雑誌名

      日本生理学雑誌

      巻: 76 ページ: 79

  • [学会発表] Luminescence imaging of HCN4 expression and phenotypic analysis of HCN4 TET-off mouse.2015

    • 著者名/発表者名
      Kozasa Y, Ohshita K, Nakashima N, Ushijima K, Takano M.
    • 学会等名
      The 92nd Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
    • 発表場所
      神戸コンベンションセンター(兵庫県神戸市)
    • 年月日
      2015-03-22
  • [学会発表] Epithelium-dependent periodical excitation in response to stretch of guinea pig seminal vesicle.2015

    • 著者名/発表者名
      Takeya M, Hayashi T, Nakamura K, Takano M.
    • 学会等名
      The 92nd Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
    • 発表場所
      神戸コンベンションセンター(兵庫県神戸市)
    • 年月日
      2015-03-22
  • [学会発表] Mechanism of the complete block of the Kir2.1 inward rectifier K+ channel under the external K+-free condition.2015

    • 著者名/発表者名
      Yanagi-Ishihara K, Itoh M, Takano M.
    • 学会等名
      The 92nd Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
    • 発表場所
      神戸コンベンションセンター(兵庫県神戸市)
    • 年月日
      2015-03-21
  • [学会発表] Zdhhc3/7, the members of protein-palmitoylation enzymes, inhibit the current amplitude of HCN2 channel.2015

    • 著者名/発表者名
      Itoh M, Ishihara K, Takano M.
    • 学会等名
      The 92nd Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
    • 発表場所
      神戸コンベンションセンター(兵庫県神戸市)
    • 年月日
      2015-03-21
  • [学会発表] 化学発光によるHCN4発言部位の可視化.2014

    • 著者名/発表者名
      小佐々優子
    • 学会等名
      第65回西日本生理学会
    • 発表場所
      琉球大学(沖縄県中頭郡西原町)
    • 年月日
      2014-10-24
  • [学会発表] Differential expression of Kir2.x inward rectifier K+ channels in neurons and glial cells in rat dorsal root ganglion and spinal cord.2014

    • 著者名/発表者名
      Murata Y, Honda Y, Yasaka T, Takano M, Masuko S, Ishihara K.
    • 学会等名
      The 37th Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2014-09-11
  • [学会発表] Analysis of cardiac arrhythmias and gene expression in MeCP2-null Mouse.2014

    • 著者名/発表者名
      Hara M, Takahashi T, Mitsumasu C, Igata S, Takano M, Okabe Y, Tanaka E, Matsuishi T.
    • 学会等名
      13th Rett Syndrome Symposium
    • 発表場所
      Chantilliy, VA, USA
    • 年月日
      2014-06-24 – 2014-06-26
  • [備考] 久留米大学研究者紹介

    • URL

      http://research.kurume-u.ac.jp/data.php?scode=76735632890988

  • [備考] 久留米大学医学部生理学講座統合自失機能部門研究業績

    • URL

      http://www.med.kurume-u.ac.jp/med/physiol2/paper.html

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公開日: 2016-06-01  

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