| 研究課題/領域番号 |
24300174
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
大橋 一夫 奈良県立医科大学, 医学部, その他 (40364062)
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| 研究分担者 |
杉本 充彦 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (80192128)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 細胞移植 / 再生医療 / 血友病 / 遺伝子治療 |
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| 研究概要 |
血液凝固第IX因子(FIX)発現の欠損が原因疾患である血友病Bあるいは血液凝固第VIII因子(FVIII)発現の欠損が原因疾患である血友病Aを対象疾患として取り上げる。平成２４年度の成果を基に、平成２５年度においては、新たな自己細胞を基盤とした細胞系を樹立することを目的に、血友病Bマウス由来肝細胞(HB-Hep)の分離・培養系の確立を行った。また、平成２４年度研究の成果である血友病モデルマウスからの分離・樹立した血液派生血管内皮前駆細胞の性状評価として、細胞シート組織体作製の要素技術開発を行った。以上の研究から以下の知見を得た。
（１）血友病B個体（マウス）からの肝細胞分離・精製と培養条件ー血友病マウスという血液凝固能が異常である個体での細胞分離・分散に適した条件設定を完了した。このことにより、取りパンブルー排泄試験で８５％以上を示す分離法が確立できた。また、これら血友病マウス由来初代肝細胞が、９０%以上のコンフルエント度を達成することができる培養条件を確立した。
（２）マウス体内肝細胞増殖系の確立ー上記（１）にて分離した血友病Bマウス初代肝細胞を増殖させる目的で、uPA/SCIDマウスの肝臓に脾臓から注入移植を行った。その結果、至適細胞数をuPA/SCIDマウス肝に移植することで、移植血友病肝細胞は選択的に増殖し、最終的には、マウス肝臓のほぼ１００％を占めることに成功した。
（３）血友病マウス個体から樹立した血液派生血管内皮前駆細胞(Blood Outgrowth Endothelial Progenitor Cells, BOECs)の性状ーFBS含有MCDB131培養液にVEGF, EGF等を添加した培養液にて培養を行ったところ、BOECsは分裂増殖を続け、初期播種細胞数と比較して２０倍以上に増殖した。また、これら増殖細胞は、温度応答性培養皿にて培養することで、細胞シートとして回収し得ることも明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（理由）平成２４年度ならびに２５年度の研究において、血友病個体から分離できる治療用自己細胞源として、マウスモデルを用いた実験を進めた結果、血液派生血管内皮前駆細胞、脂肪組織由来幹細胞、そして成熟肝細胞の３系統が有用である可能性を明らかとした。また、少なくとも有用であることを明らかとした。また、血液凝固発現のための遺伝子導入として、ウイルスベクターの選択にも着手している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２４年度、２５年度の研究成果をさらに確かなものとし、また、発展させるため、血友病個体由来の血液派生血管内皮前駆細胞（BOECs）を用いた移植実験、および、uPA/SCIDマウス肝臓内で増殖した血友病マウス肝細胞分離技術の確立などをすすめていく。特に重点を置く項目を以下に列記する。
（１）BOEC細胞への遺伝子導入ー元来欠損している血液凝固第IX因子を発現させるために、アデノウイルスベクター等を用いて、遺伝子導入を行い、第IX因子の産生状況や産生第IX因子の生理活性などを探索する。
（２）BOEC細胞シートの移植法の開発ー同系マウスの皮下等の部位に、BOEC細胞シートを貼付し、生体内での生着程度などを探索する。
（３）uPA/SCIDマウス肝臓からの血友病肝細胞の分離・利用
レシピエントuPA/SCIDマウスにおいて血友病肝細胞の増殖置換程度を把握し、ほぼ１００％近くまで肝臓が移植血友病肝細胞で置換されていることが推測されているマウスを用いて、肝細胞を分離精製する。手法は、２段階コラゲナーゼ灌流法にて行い、viable肝細胞の取得状況や機能を探索しつつ、分離技術の確立を目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成２５年度で予定していた実験は、順調に進行した。予定していた以上に順調に進行したため、追加項目もふくめて進捗した。そのため、培養時に使用する増殖因子等の費用を節約できた。また、それら結果を評価するための測定キットの使用も予定より少ない使用で正確な実験を行うことができた。
マウス実験遂行のための購入費、飼育費、管理費、手術費等に使用するために、次年度使用とした。
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