| 研究課題/領域番号 |
24300260
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
永井 竜児 東海大学, 農学部, 准教授 (20315295)
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| 研究分担者 |
藤原 章雄 熊本大学, 生命科学研究科, 助教 (70452886)
荒木 朋洋 東海大学, 農学部, 教授 (20193071)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 翻訳後修飾 / 脂肪細胞 / 生活習慣病 / 糖尿病 / フマル酸 |
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| 研究概要 |
脂肪細胞は糖・脂質代謝制御に関して重要な役割を演じ、その機能不は糖尿柄、高血圧、脂質異常症を誘発し、結果的に動脈硬化をはじめとする様々な老化関連疾患の発症を促進する。我々は、脂肪細胞が高血糖状態に曝されると、TCAサイクルの中間体であるフマル酸の細胞内濃度が上昇し、フマル酸が蛋白と反応してS-(2-succinyl)cysteine(2SC)が生成すること、さらに本反応によってアディポネクチンをはじめ様々な細胞内蛋白の機能が低下する新規な翻訳後修飾経路を見いだした。今年度、液体クロマトグラフィータンデム質量分析装置(LC-MS/MS)を用いて、脂肪細胞および血清中2SCの測定系の確立を行った。2SCはN-acetyl-Cys 30mM、N-ethylmaleimide 60mMを反応させた後、薄層クロマトグラフィーで生成物を確認した。生成物をダウエックス50カラムにアプライした後、5Mアンモニアで溶出した。2SCと思われるピークをアミノ酸分析で純度検定、NMRで構造を確認し、LC-Ms/Msによる2sc測定の標準試料を得た。Hillicカラムを備えたLC-MS/MS分析では溶出時間10分に、親イオン238、プロダクトイオン121、221で2SCの測定が可能となった。3T3-L1細胞を定法にしたがって脂肪細胞に分化させた後、回収した細胞蛋白0.1mgを6N塩酸、100℃で加水分解した結果、脂肪細胞の培養期間に応じて細胞内2SC含量が上昇することが確認された。同様な結果をラット腸管膜より得た脂肪細胞でも確認した。また、糖尿病ラットの血清を同様に加水分解することによって、血中2SCが測定可能となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
既に2SCはGC-MS/MSで測定されていたが、新規に立ち上げたLC-MS/MSによる2SC測定系の確立に予想外に時間を費やした。しかし、大目的である脂肪細胞における2SCの測定は可能となったため、当初の計画である2SC生成に対する糖原性アミノ酸の効果はすぐに測定可能である。
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| 今後の研究の推進方策 |
2SCの検出が可能となったが、塩酸加水分解したサンプルを無処理のままLC-MS/MS解析を行うとプローブが汚れ、次第に感度が低下することが確認された。そのため、2SC生成に関与する経路の探索を進めると同時に、分析時の最適な前処理条件も検討する必要がある。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
LC-MS/MSで2SCを検出する際、親イオンおよびプロダクトイオンを正確に評価する目的で、分子の開裂パターンを計算するソフトウェア(Mass frontier)を購入する。また脂肪細胞の培養メディウム並びに2SCの生成に関与すると考えられる各種有機酸を購入する。
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