| 研究課題/領域番号 |
24310041
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小林 純也 京都大学, 放射線生物研究センター, 准教授 (30301302)
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| 研究分担者 |
奥井 理予 桐蔭横浜大学, 公私立大学の部局等, 講師 (20327654)
林 幾江 広島大学, その他の研究科, 助教 (00346503)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | ゲノム不安定性 / nucleolin / クロマチン / DNA損傷 / DNA修復 |
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| 研究概要 |
核小体タンパク質nucleolinはリボソーマルRNA合成、核小体形成に機能しているが、近年の研究からクロマチンリモデリングを介して転写活性化に寄与すること、我々の最新の研究からDNA二重鎖切断(DSB)修復時にもクロマチンリモデリングを介して、とくに相同組換え修復で機能することが示唆されている。さらに多くの癌細胞では高発現しており、ゲノム安定性に寄与する可能性が考えられるため、本研究では、nucleolinが相同組換え修復以外のDNA修復応答にも機能するかを明らかにするとともに、そのDNA修復時に相互に機能するクロマチンリモデリング因子をプロテオミクス解析で同定し、これらnucleolin／クロマチンリモデリング因子複合体がゲノム安定性の維持、がん化への関与を明らかにすることを目的としている。
25年度研究ではSupFアッセイという遺伝子突然変異を検出できる系を用いnucleolinノックダウン細胞で検討した。その結果、紫外線、アルキル化剤メチルメタンサルフォネート(MMS）損傷時には損傷DNAの複製が著しく低下して、突然変異頻度が上昇することから、紫外線やDNAアルキル化損傷での修復応答に重要な機能が示唆された。また、ウエスタンブロットにおいてもこれらDNA損傷処理時にはノックダウン細胞でDNA損傷の蓄積が見られ、nucleolinが重要な役割を持つことが示唆された。
このように様々なタイプのDNA損傷について役割を持つnucleolinと相互作用する因子をプロテオミクス解析で同定を試みたところ、複数のクロマチンリモデリング関連因子を明らかにすることができた。これら因子がDSB修復に機能するのであれば、DSB損傷部位へ蓄積すると考えられるので、クロマチン免疫沈降法で検討を行うと、同定した因子の一つでDSB損傷部位への蓄積が見られ、この因子はnucleolinとともにDNA損傷応答に昨日する可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題は3年の研究計画であり、25年度は中間年であり、nucleolinがどのようなDNA損傷の種類で機能しうるかをまず明らかにすることを計画した。その結果、突然変異解析SupFアッセイで複数のタイプのDNA損傷の修復応答への関与が示唆され、他の解析によってもそれが確認され、計画通りに解析が進んだと考えられる。
これとともにnucleolinとDNA損傷発生により相互作用、複合体形成する因子の同定も計画したが、プロテオミクス解析等で複数の候補因子の同定に成功し、これら因子のうちの一つで、DSB損傷部位への集積も明らかにできたことから、DNA損傷に関与する可能性も示され、平成25年度研究も計画通り、概ね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
25年度までにnucleolinが機能する可能性のあるDNA損傷の種類を放射線によるDNA二重鎖切断修復を含め、複数明らかにしており、ゲノム安定性へ大きな寄与が考えられる。それゆえ26年度研究では、ゲノム不安定化の結果で起こる癌化が、nucleolinの発現・機能変化が関係するのかを明らかにする。また、25年度研究からnucleolinと相互作用するクロマチンリモデリング関連因子を複数同定しており、これら因子のnucleolinとの機能的関係、さらには癌化への寄与についても明らかにすることを計画している。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
DNA損傷発生時にnucleolinと相互作用する因子の同定をプロテオミクス解析で行うことを計画し経費計上していたが、同定解析が予想以上に順調に進んだため、想定した経費より少ない額となり、残額を次年度へ繰り越すこととした
25年度に計画したプロテオミクス解析では複数因子とnucleolinとの相互作用が明らかとなったが、さらにこれらが相互的に複合体を形成して、さらに他の因子とも結合している可能性が考えられるので、平成25年度から繰り越した経費を用いて、これらのプロテオミクス解析による同定について使用する予定です。
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