DNAクロスリンク修復におけるCtIPヌクレアーゼ制御機構の解析

2012 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24310042
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 高田 穣 京都大学, 放射線生物研究センター, 教授 (30281728)
• 研究分担者: 海野 純也 京都大学, 放射線生物研究センター, 研究員 (50614153)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: Fanconi anemia / FANCD2 / CtIP / モノユビキチン化 / DNA損傷応答 / DNA修復 / チェックポイント

研究概要

ゲノムがDNAクロスリンク傷害をうけると、ファンコニ貧血(FA)経路の活性化によって
FANCD2/FANCI(ID)複合体がモノユビキチン化をうけ、DNA傷害部位に結合する。モノユビキチン化ID複合体は、FANlヌクレアーゼをはじめとした下流エフェクター分子の働きをコーディ
ネートし、DNAクロスリンク修復に必須の機能を発揮すると考えられる。FA経路の欠損病態であるFAでは、発がんと骨髄幹細胞不全という重大な結果を伴うため、ID複合体の機能を理解することは医学的に重要である。我々は、FANCD2に会合するあらたなエフェクター分子として、DNA二重鎖切断修復に重要なヌクレアーゼ因子であるCtIP蛋白質を同定した。本研究は、この発見をもとにCtIPのID複合体による制御機構を解析し、DNAクロスリンク修復における役割を解明しようとするものである。FAの病態解明と、将来のFA経路の人為的操作へとつながる成果を目指す。
本年度までに以下の諸点を明らかにした。
精製したヒトFANcD2複合体に、FANCIなどの既知の会合蛋白以外にctIPの存在を確認した(首都大学東京、礒辺教授らとの共同研究)。さらに精製したFANCD2と(早稲田大胡桃坂教授との共同研究)と購入したGST_CtIPとのインビトロの結合をプルダウンによって確認した。さらに、CtIPとFANcD2の会合は、免疫沈降法、酵母2ハイブリッド法、ほ乳類細胞における2ハイブリッド法などでも確認された。FANCD2は、クロスリンク障害部位に集積してフォーカスを形成するが、ctIPのフォーカス形成はFANcD2と共局在しており、さらにFANcD2の存在とユビキチン化に依存していた。さらに、CtIPとFANCD2との会合ドメインの同定に成功した。これに基づき、点変異による会合不能の変異体を作製し、局在と機能について検討を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初予定したデータが順調に得られており、おおむね順調に進展していると考えている

今後の研究の推進方策

FANcD2とCtIP蛋白質の会合様式の詳細を明らかにすることが重要である。そのため、いまだに不明確なCtIP自体がユビキチンと結合する可能性を検討する。

次年度の研究費の使用計画

抗体の作成を受託して行っており、その完成を待って支出するためには、次年度に繰り越す必要があった。翌年度にはその費用を支出し、さらに、様々な試薬消耗品とユビキチン蛋白質などの特殊試薬購入費用に充てる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Synergistic Elfect of Olaparib with Combination of Cisplatin on PTEN-Deficient Lung Cancer Cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Minami D, Takigawa N, Takeda H, Takata M, Och i N, Ichihara E, Hi samo to A, Hotta K, Tanimoto M, Kiura K.
  • 雑誌名: Mol Cancer Res. 巻: 11(2) ページ: 140-8
  • DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-12-0401.
  • 査読あり
• [雑誌論文] NBSl directly activates ATR independently of MRE11 and T0PBP1. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi M, Hayashi N, Takata M, Yamamoto K,
  • 雑誌名: Genes Cells. 巻: 18(3) ページ: 238-46
  • DOI: 10.1111/gtc.12031.
  • 査読あり
• [雑誌論文] DNA robustly st imulates FANCD2 monoubiauitylation in the complex with FANCI. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato K, Toda K, Ishiai M, Takata M, Kurumizaka H.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. 巻: 40(10) ページ: 4553-61.
  • DOI: 10.1093/nar/gks053.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Matched sibling donor stem cell transplantation for Fanconi anemia patients with T-cell somatic mosaicism. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yabe M, Shimizu T, Morimoto T, Koike T, Takakura H, Tsukamoto H, Muroi K, Oshima K, As ami K, Takata M, Yamashita T, Kato S, Yabe H.
  • 雑誌名: Pediatr Transplant. 巻: 4 ページ: 340-5
  • DOI: 10.1111/j.1399-3046.2012.01669.x.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hi s tone chaperone activity of Fanconi anemia proteins, FANCD2 and FANCI, is required for DNA crosslink repair. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato K, Ishiai M, Toda K, Furukoshi S, Osakabe A, Tachiwana H, Takizawa Y, Kagawa W, Kitao H, Dohmae N, Obuse C, Kimura H, Takata M, Kurumizaka H.
  • 雑誌名: EMBO J. 巻: 31 (17) ページ: 3524-36
  • DOI: 10.1038/emboj.2012.197.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mcm8 and Mcm9 Form a Complex that Functions in Homologous Recombination Repair Induced by DNA Inters trand Crosslinks. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nishimura K, Ishiai M, Horikawa K, Fukagawa T, Takata M, Takisawa H, Kanemaki MT.
  • 雑誌名: Mol Cell. 巻: 47(4) ページ: 511-22
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2012.05.047.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A ubiaui t in-binding protein, FAAP20, links RNF8-mediated ubiaui t inat ion to the Fanconi anemia DNA repair network. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yan Z, Guo R, Paramasivam M, Shen W, Ling C, Fox D 3rd, Wang Y, Oostra AB, Kuehl J, Lee DY, Takata M, Hoatlin ME, Schindler D, Joenje H, de Winter JP, Li L, Seidman MM, Wang W
  • 雑誌名: Mol Cell. 巻: 47(1) ページ: 61-75
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2012.05.026.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Establishment of the DNA repair-defective mutants in DT40 cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ishiai M, Dchida E, and Takata M.
  • 雑誌名: Methods Mol Biol. 巻: 920 ページ: 39-49
  • DOI: 10.1007/978-1-61779-998-3_4.
  • 査読あり
• [学会発表] Molecular pathogenesis of Fanconi anemia (2012)
  • 著者名/発表者名: Minoru Takata
  • 学会等名: 第54回日本小児血液・がん学会学術集会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • 年月日: 20121201-20121202
• [学会発表] Genetic interplay between the Fanconi anemia pathway and aldehyde metabolism in humans (2012)
  • 著者名/発表者名: Minoru Takata, Asuka Hiral, Naoya Suzuki, Akira Niwa, Tatsutoshi Nakahata, Hiromasa Yabe, Megumu K. Saito, Keitaro Matsuo, Miharu Yabe
  • 学会等名: 28th RBC-NIRS INTERNATIONAL SYMPOSIUM
  • 発表場所: コープイン京都(京都府)
  • 年月日: 20121129-20121130
• [学会発表] Genetic interplay between the Fanconi anemia pathway and aldehyde metabolism in humans (2012)
  • 著者名/発表者名: Minoru Takata, Asuka Hira, Naoya Suzuki, Akira Niwa, Tatsutoshi Nakahata, Hiromasa Yabe, Megumu K. Saito, Keitaro Matsuo, Miharu Yabe
  • 学会等名: The 8th 3R Symposium
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場(兵庫県)
  • 年月日: 20121125-20121128
• [学会発表] Crosstalk signaling between checkpoint and the Fanconi anemia DNA repair pathway (2012)
  • 著者名/発表者名: Junya Unno, Junya Tomida, Tomoko Shigechi, Akiko l taya, and Minoru Takata
  • 学会等名: 第71回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: ロイトン札幌・ホテルさっぽろ芸文館・札幌市教育文化会館(北海道)
  • 年月日: 20120919-20120921
• [備考]
  • URL: http://house.rbc.kyoto-u.ac.jp/Late_Effect/Japanese_site/Welcom.html