| 研究課題/領域番号 |
24310046
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
田渕 圭章 富山大学, 生命科学先端研究センター, 准教授 (20322109)
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| 研究分担者 |
星 信彦 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10209223)
近藤 隆 富山大学, 大学院・医学薬学研究部(医学), 教授 (40143937)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 内分泌かく乱物質 / 複合影響 |
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| 研究概要 |
環境化学物質の複合影響を「細胞ストレス保護システムに対する作用」,すなわち,ERストレスやオートファジーを指標として明らかにすることを目的として研究を行った.今年度は,この研究の一環として,以下の実験成績を得た.
骨芽前駆細胞MC3T3-E1細胞への小胞体(ER)カルシウムポンプ阻害剤thapsigargin (TG)の処理は,ERストレスマーカーであるGRP78とCHOPのタンパク質発現量を顕著に増加させた.また,この実験条件下では,細胞周期のG1とG2/M期の増加を伴う細胞増殖の停止が観察された.一方,アポトーシスの指標であるDNAの断片化はTG処理により増加しなかった.GeneChipシステムによる遺伝子の網羅的発現解析の結果,TGにより発現が3倍以上変動する遺伝子が683個見つかり,階層的クラスター解析により4種類のクラスターに分類された.各々の遺伝子クラスターの遺伝子機能解析により,発現が増加するクラスターIには,既存のERストレス応答カノニカルパスウェイに関連する遺伝子が数多く観察された.
近年,熱ストレスによりERストレスが誘導されることが報告された.正常ヒト繊維芽細胞を用いて,弱い熱ストレス(41℃)によりERストレスが誘導されることを確認した.二種類の細胞で共通に発現変動する遺伝子群から,ERストレスに関連する遺伝子ネットワークを明らかにした.このネットワークに含まれる遺伝子は,ERストレスにより発現が上昇した.この遺伝子の発現上昇は,四種類の正常ヒト繊維芽細胞で確認することができた.
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
概要に記載したように,ERストレスに関するタンパク質レベルと遺伝子レベルの実験系を確認することができた.特に,網羅的な遺伝子発現解析からERストレスに関する遺伝子クラスターを明らかにすることができた.また,動物実験において,野生型(C57BL/6)の妊娠マウスにダイオキシンTCDDを投与し,雄産子の脳,肝臓,脾臓と精巣を評価する実験系の構築を目指して実験を行っている.オートファジーの検討を行っていないので,達成度は「(3)やや遅れている」とした.
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞レベルで環境化学物質が細胞ストレス保護システムに影響を与えるか否かをERストレスやオートファジーを指標として検討する.膵ベータ細胞,脂肪前駆細胞,間葉系幹細胞(脂肪,骨,平滑筋に分化する能力を持つ)を中心にして,精巣セルトリ細胞と骨芽細胞や軟骨前駆細胞等を使用する.また,昨年度構築した口腔上皮細胞も用いる.ビスフェノール類やダイオキシン類等できるだけ広範にスクリーニングを行う.また,フッ化水素の効果も検討する.オートファジーは,LC3-II/LC3-1の増加で評価する.
ERストレスを誘導する幾つかの条件下において,Gene Chipシステムを用いて網羅的遺伝子発現解析を行う.また,次世代シーケンサーを用いてその結果を検証する.
細胞レベルでERストレスやオートファジーを誘導する幾つかの条件において,動物レベルでこれらの誘導の有無を検証する.野生型(C57BL/6)の妊娠マウスにダイオキシンTCDD(50,500および5000ng/kg)を投与し,雄産子を胎齢18.5日(El8.5).2週齢(2wk).8週齢(8wk)で採材し.脳.肝臓.牌臓と精巣を摘出し.評価する.
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| 次年度の研究費の使用計画 |
上記理由により若干の研究の遅れが生じ,そのために次年度への繰越金が発生した.この繰越金を含めて,次年度の研究を実施するために以下の使用を計画している.試薬類:1,800千円.培養器具類:1,910千円.抗体類:600千円.遺伝子発現解析・次世代シーケンサー試薬類:2,000千円.国内旅費:200千円.謝金等:50千円.
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