環境化学物質の複合影響による細胞ストレス保護システムの異常と疾患との関連性の検証

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24310046
• 研究機関: 富山大学
• 研究代表者: 田渕 圭章 富山大学, 生命科学先端研究センター, 准教授 (20322109)
• 研究分担者: 星 信彦 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10209223) ; 近藤 隆 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (40143937)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 内分泌かく乱物質 / 複合影響

研究概要

温度感受性大型T抗原遺伝子導入トランスジェニックラットを用いて，種々の上皮の機能を保持した不死化口腔上皮細胞モデル（ROE2細胞）を構築した．本モデルを用いて，フッ化ナトリウム（NaF）による毒性発生のメカニズムを解析した．低濃度のNaFは細胞死に影響をおよぼさなかったが，比較的高濃度のNaF (2 mMおよび4 mM) は，カスパーゼ3の活性化やミトコンドリアの機能低下を伴うアポトーシスを誘導した．GeneChipシステムを用いて発現変動する遺伝子を網羅的に明らかにし，バイオインフォマティクスツールにより，遺伝子の階層解析と遺伝子ネットワーク解析を行った．その結果，このアポトーシスが誘導される時，ERストレスに関連したDDIT3やHSPA5を含む遺伝子ネットワークが関与する可能性が示された．RNAi法を用いてDDIT3をノックダウンした時，NaFによるアポトーシスが有意に抑制されたのでNaFのアポトーシス誘導にはDDIT3やDDIT3を含む遺伝子ネットワークが関連することが示された．また，現在，本細胞モデルで，NaF，ビスフェノールAやフタル酸化合物の複合影響をERストレスやオートファジーを指標として解析している．
さらに，今年度は，以下の成果を得ることができた．1) 不死化精巣上体細胞において，血液―精巣上体関門の透過性にTGFβが関与することを明らかにした．2) 胎児マウスへのダイオキシン2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)の暴露は，AhR-responsive element IIIを介してチロシンハイドロキシラーゼ(TH)の高発現を誘導し，中脳のTH免疫反応性の神経の異常発達を引き起こすことが判った．3) 骨のモデルである金魚のウロコの実験系において，polychlorinated biphenyl (118)が破骨細胞を活性化して，骨の吸収を促進することを明らかにした．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

概要に記載したように，新規にラット口腔上皮細胞モデルを構築することができた．現在，この細胞モデルや骨芽細胞株を用いて，フッ化ナトリウム，ビスフェノールA，フタル酸化合物等の複合影響を評価している．また，動物実験において，胎児マウスへのダイオキシンの効果を明らかにすることができた．妊娠マウスにダイオキシンTCDDを投与して，雄産子の脳，肝臓，脾臓と精巣を評価する実験系の構築を行っている．
概要に記載した成果を得ることができたので，達成度は「②おおむね順調に進展している」を選択した．

今後の研究の推進方策

環境化学物質の複合影響を「細胞ストレス保護システム」即ち，ERストレスやオートファジーを指標として検討する．口腔上皮細胞，骨芽細胞，脂肪前駆細胞，間葉系幹細胞（脂肪，骨，平滑筋に分化する能力を持つ）において，フッ化ナトリウム (NaF)，ビスフェノールA，フタル酸化合物等の複合影響をmRNAやタンパク質レベルで評価する．ERストレスは，HSPA5 (Bip)をマスター制御因子として，主にPERK, IRE1とATF6シグナル伝達系が存在する．これらの経路をRNAi法を用いてノックダウンし，複合影響における役割を明らかにする．オートファジーは，LC3-II/LC3-Iの増加で評価する．ERストレスとオートファジーとの関連性が存在するか否かを評価する．ERストレスを誘導する幾つかの条件下において，GeneChipシステムや次世代シーケンサーを用いて遺伝子レベルで検証する．
細胞レベルでERストレスやオートファジーを誘導する条件において，動物レベルでこれらの誘導の有無を検証する．妊娠マウスにダイオキシンTCDD（50，500および5000 ng/kg）を投与し，雄産子への影響を評価する．脳，肝臓，脾臓と精巣を摘出し，ERストレスやオートファジーを評価する．

次年度の研究費の使用計画

研究費を効率よく必要最小限の使用に留めたので，次年度への繰越金が発生した．また，GeneChipシステムや次世代シーケンサーを用いて遺伝子を網羅的に調べる実験が計画よりも少ない実施であったことも理由として挙げられる．繰越金を含めて，以下の使用を計画している．
次年度の研究を実施するために以下の使用を計画している．試薬類：1,000千円．培養器具類：535千円．抗体類：500千円．遺伝子発現解析試薬類：2,000千円．国内旅費：400千円．謝金等：100千円．その他（論文投稿料）：200千円．

研究成果

• [雑誌論文] Development of oral epithelial cell line ROE2 with differentiation potential from transgenic rats harboring temperature-sensitive simian virus40 large T-antigen gene (2014)
  • 著者名/発表者名: Tabuchi Y, Wada S, Ikegame M, Kariya A, Furusawa Y, Hoshi N, Yunoki T, Suzuki Y
  • 雑誌名: Exp Anim 巻: 63 ページ: 31-44
  • DOI: 10.1538/expanim.63.31
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fetal exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin transactivates aryl hydrocarbon receptor-responsive element III in the tyrosine hydroxylase immunoreactive neurons of the mouse midbrain (2014)
  • 著者名/発表者名: Tanida T, Tasaka K, Akahoshi E, Ishihara-Sugano M, Saito M, Kawata S, Danjo M, Tokumoto J, Mantani Y, Nagahara D, Tabuchi Y, Yokoyama T, Kitagawa H, Kawata M, Hoshi N
  • 雑誌名: J Appl Toxicol 巻: 34 ページ: 117-126
  • DOI: 10.1002/jat.2839
  • 査読あり
• [雑誌論文] Polychlorinated biphenyl (118) activates osteoclasts and induces bone resorption in goldfish (2014)
  • 著者名/発表者名: Yachiguchi K, Matsumoto N, Haga Y, Suzuki M, Matsumura C, Tsurukawa M, Okuno T, Nakano T, Kawabe K, Kitamura KI, Toriba A, Hayakawa K, Chowdhury VS, Endo M, Chiba A, Sekiguchi T, Nakano M, Tabuchi Y, Kondo T, Wada S, Mishima H, Hattori A, Suzuki N
  • 雑誌名: Environ Sci Pollut Res Int 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] TGFβs modulate permeability of the blood-epididymis barrier in an in vitro model (2013)
  • 著者名/発表者名: Stammler A, Muller D, Tabuchi Y, Konrad L, Middendorff R
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e80611
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0080611
  • 査読あり