| 研究課題/領域番号 |
24310146
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 大阪府立公衆衛生研究所 |
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研究代表者 |
駒野 淳 大阪府立公衆衛生研究所, 感染症部, 主任研究員 (60356251)
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| 研究分担者 |
武田 哲 国立感染症研究所, エイズ研究センター, 研究員 (50396959)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 移植・再生医療 / バイオテクノロジー / レンチウイルス様ナノ粒子 / 脱分化法 / ナノバイオ |
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| 研究概要 |
我々はレトロウイルス基礎研究をもとにレンチウイルス様ナノ粒子(Lentivirus-like nanoparticle,LENA)を用いたタンパク質デリバリー法を開発した。iPS細胞を利用した再生医療において、治療用細胞の悪性化やウイルスベクターの混入には大きな懸念がある。これを払拭するにはタンパク質デリバリー法は最適である。本研究ではLENA技術をコアとして既法で得られるものより格段に安全性の高いiPS細胞を樹立する方法を確立する。
概念検証を行うため、本年度はOct3/4によるヒト繊維芽細胞からCD45^+細胞への脱分化誘導能の検証を試みた。Oct3/4導入用LENA発現ベクターを構築して、293T細胞からOct3/4-LENAを調整した。粒子内におけるOct3/4の安定性をイムノブロット法にて検証した。LENA系によるヒト繊維芽細胞からiPS細胞への脱分化誘導を試みたが、CD45^+細胞への脱分化は検出されなかった。Oct3/4の転写因子機能を検証するためOct3/4活性を検出するレポータープラスミドを一過性に導入したHeLa細胞にOct3/4-LENAを暴露し、経時的にルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、転写活性は検出限界以下となった。本実験系を繰り返し施行する中で、LENAによる活性のある転写因子の細胞内導入には鋭敏かつ安定なレポター系の作出とそれに基づく適切なLENA産生プロトコルおよび暴露プロトコルの評価が重要である事が明らかになった。これはLENA法を他の脱分化誘導因子に適応拡大し、LENA系によるヒト繊維芽細胞からiPS細胞への脱分化誘導を行う上で極めて重要な基盤情報となる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度はOct3/4導入用LENAによる概念検証実験として、Oct3/4導入用LENAの調整とタンパク質導入能の検証とOct3/4-LENAによるヒト繊維芽細胞のダイレクトリプログラミングの検証を企図していたが、転写因子の活性検出において実験系を改善すべきである事が判明したため、これに注力した事が研究計画の推進に影響している。
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| 今後の研究の推進方策 |
LENAによる転写因子活性導入の効率を測定する実験系の改良を行い、LENA産生プロトコルおよび暴露プロトコルの最適化を第一の目標とする。具体的なOct3/4導入によるエフェクター効果を検出する鋭敏且つ定量的な方法として、signaUnoise比が高いレポーターHeLa細胞株を樹立しluciferase reporter活性の検出を試みると同時に、RT=PCRによる内在性Oct3/4標的遺伝子発現誘導を評価する。これを確立した上で再度Oct3/4-LENAによるヒト繊維芽細胞のダイレクトリプログラミングの検証を行い、他の脱分化誘導因子に適応拡大する。ベクター系と物理的なLENA含有転写因子の安定性評価系が確立したので、他の脱分化因子Sox2、H-f4、c-Mycへの適応拡大の第一段階として各因子を含有するLENAの構築を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
直接経費次年度使用額は物品費として計上し、円滑な研究推進に供する。
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