| 研究課題/領域番号 |
24310158
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岩井 成憲 大阪大学, 基礎工学研究科, 教授 (10168544)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | DNA / 構造変化 / ジスルフィド結合 / HPLC / タンパク質 / 分子認識 |
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| 研究概要 |
2本鎖DNAは水溶液中で直線状の二重らせん構造をとるが、損傷による化学構造の変化やタンパク質の結合等により折れ曲がることがあり、そのような構造変化はタンパク質によるDNA認識に重要である。そこでこの形の構造変化が起こると主溝の両側に付けた二つのメルカプトアルキル基の間にジスルフィド結合が形成されるように修飾された2本鎖オリゴヌクレオチドを設計・合成し、DNAのらせん軸の折れ曲がりを検出あるいは固定化する方法を開発することを目的とした。平成24年度はシスプラチン付加体を有する2本鎖に関して予備実験で得られた結果を検証・改良することにより方法論として確立し、塩基欠落部位を有する2本鎖に対しこの方法を応用してその動的構造の解明を試みた。基本的にメルカプトブチル基(C4)あるいはメルカプトプロピル基(C3)を2'位に上向きに付けた修飾ヌクレオシドを5～7塩基対離してそれぞれの鎖に入れた2本鎖中でのジスルフィド結合の形成をHPLCにより分析したが、反応速度に再現性が得られなかったため溶存酸素濃度を測定して反応中の溶存酸素を飽和状態にすることにより信頼性の高い結果が得られることがわかった。この手法を用いてシスプラチン付加体および塩基欠落部位の安定アナログを有する2本鎖とそれらを含まない2本鎖におけるジスルフィド結合の形成を調べたところ、いずれも修飾ヌクレオシド間の挿入を6塩基対としたときに損傷の有無による違いが顕著に示され、らせん軸の折れ曲がりによると考えられるジスルフィド結合の形成が検出された。また、シスプラチン付加体の場合の形成速度はC4>C3であったのに対し、塩基欠落部位アナログではC4≒C3であったことから後者の動的な構造変化が示唆された。そこで、塩基欠落部位アナログを有しジスルフィド結合が形成された2本鎖を大量に調製し、連携研究者にNMRによる構造解析を依頼した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請書に記載した当初の計画の中で実験結果の再現性が懸念されたが、操作手順を詳細に見直すことにより高い再現性を得ることができた。また、塩基欠落部位についても信頼性の高い結果が得られたため、試料を調製して連携研究者に構造解析を依頼した。2本鎖の安定性が十分ではなかったので塩基配列を変更して再調製と再測定を行ったためまだ構造決定には至っていないが、平成25年の夏までにはその結果を得られそうである。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度の成果を(6-4)光産物を有するDNAに応用し、UV-DDBタンパク質およびXPCタンパク質のDNA認識に関する研究を行う。メルカプトアルキル基と(6-4)光産物を有するオリゴヌクレオチドの合成法を検討する必要があるが、既報に従って塩基部無保護法を試してみる予定である。
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