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2014 年度 実績報告書

ジスルフィド結合の形成を利用したDNAの構造変化の検出と分子認識機構解明への応用

研究課題

研究課題/領域番号 24310158
研究機関大阪大学

研究代表者

岩井 成憲  大阪大学, 基礎工学研究科, 教授 (10168544)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2015-03-31
キーワードDNA / 構造変化 / ジスルフィド結合 / HPLC / タンパク質 / 分子認識
研究実績の概要

前年度の課題として実験者毎の再現性の問題があったが、反応容器や酸素の供給方法等を検討することにより元の反応速度に近い結果を得ることができたので、シスプラチン付加体、塩基欠落部位、(6-4)光産物のそれぞれを有し主溝を挟んで二つのメルカプトブチル基またはメルカプトプロピル基を持つ計6種類の2本鎖について、HPLCのピーク面積を求めて原料の消失と鎖間ジスルフィド結合の形成をグラフ化した。その結果、固定された折れ曲がりを有するシスプラチン付加体の場合にはジスルフィド結合の形成速度がアルキル鎖の長さに依存したのに対し、塩基欠落部位と(6-4)光産物ではいずれも同様にその依存性が見られなかったことから、これらの損傷を有するDNAの動的構造変化を捉えることができたと結論づけた。
次に、この方法をタンパク質のDNA認識機構の解明に応用することを目指した。研究代表者らは以前にヌクレオチド除去修復の損傷認識においてUV-DDBタンパク質が損傷部位に結合してDNAを折り曲げることを明らかにし、次に働くXPCタンパク質はそのようにして形成されたDNAの折れ曲がり構造を認識するのではないかというモデルを提唱した。これを証明するためにジスルフィド架橋により固定された折れ曲がりDNAを利用することにしたが、(6-4)光産物を有するDNAには架橋なしでもXPCタンパク質がある程度結合したため、損傷としてシクロブタンピリミジンダイマー(CPD)を使用した。また、前年度に解明されたNMR構造ではメルカプトブチル基を用いた場合にベンド角が非常に大きかったため、メルカプトペンチル基も試した。架橋されたCPD DNAを32Pで標識しXPCタンパク質と混ぜてゲル電気泳動を行うと、架橋がない場合と有意な差で複合体のバンドが検出された。この結果は、上記のDNA認識モデルが正しいことを示している。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

26年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

26年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (1件)

すべて 2015

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件)

  • [雑誌論文] Analysis of structural flexibility of damaged DNA using thiol-tethered oligonucleotide duplexes2015

    • 著者名/発表者名
      Masashi Fujita, Shun Watanabe, Mariko Yoshizawa, Junpei Yamamoto, Shigenori Iwai
    • 雑誌名

      PLoS ONE

      巻: 10 ページ: e0117798

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0117798

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり

URL: 

公開日: 2016-06-01  

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