| 研究課題/領域番号 |
24310165
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
武井 史恵 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (30252711)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | PCR / 蛍光分子 / へアピンプライマー / ウイルス検出 |
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| 研究概要 |
HP-PCR法によるウイルスの有無を確定診断するPCR条件の確立
まずは今まで行っていた蛍光減少型のHP－PCR法を使ったHCVのウイルス検出に応用した。HCVはRNAウイルスであるため、逆転写した後にPCRが必要となる。ウイルスに特異的なヘアピン構造が付加された二種類のヘアピンプライマーを用意し、1チューブ内に患者の血清からの抽出液とプライマーをポリメラーゼを混合し逆転写-PCRを行った。PCRは進行し、夾雑物存在下でもウイルスの検出が可能であることが明らかとなった。またHCVだけでなく、熱帯地方で流行するチクングニア熱にも応用したところ、他のウイルス存在下でもチクングニア熱ウイルスのみを特異的に検出出来ることが分かった。またこの方法は、PCRの開始前と終了時の蛍光を測定するだけで、その蛍光強度の差により、定量も可能であることが明らかとなった。また、RNAウイルスだけでなく、DNAウイルスに対しても同様に検出可能であることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度に目的としたHP-PCR法によるウイルスの有無を確定診断するPCR条件の確立において、我々が今まで行っていた蛍光減少型のHP－PCR法を使って、HCV, チクングニア熱の検出を行い、HP-PCR法によって定量的、かつ迅速、簡便にウイルス検出が可能であることを明らかにした。一方、蛍光分子をDNA上に共有結合し、蛍光増加型PCRに応用した場合、プライマーの合成に手間がかかり、新たな合成方法もしくは蛍光増加型検出法の開発が必要となることが分かった。更なる検討が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２６年度は平成２５年度の結果をふまえ、新たな蛍光増加型のPCR法の開発、そして蛍光分子の最適化を行う。さらに蛍光減少型のHP-PCR法だけでなく、新たに開発した蛍光増加型HP-PCR法をウイルス検出に応用する。DNAウイルスだけでなく、逆転写が必要なRNAウイルスにも応用し、蛍光増大型の簡便、迅速なPCRモニタリングシステムの開発を行う。更にウイルスの亜型まで検出できる方法について検討を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
25年度は研究補助員を雇用する予定であったが、必要なスキルを持った補助員が見つからず、補助員を雇用しなかったため、次年度の使用額が生じた。
今年度は既にある機器を使用した評価と、合成を中心に行う予定であり、それに伴う器具類や試薬等の消耗品を中心に申請を行う。特に蛍光分子の合成においては、有機溶媒、試薬等を数多く使う。また、２５年度までの成果報告を行うために、旅費、論文投稿費にも使用する予定である。
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