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2012 年度 実績報告書

先端の構造解析技術を駆使したニトリル水和酵素ファミリーの触媒機構と成熟化機構解明

研究課題

研究課題/領域番号 24350082
研究種目

基盤研究(B)

研究機関東京農工大学

研究代表者

尾高 雅文  東京農工大学, 大学院・工学研究院, 准教授 (20224248)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2015-03-31
キーワード酵素反応機構 / 金属酵素 / 構造生物学 / 時分割結晶構造解析 / 中性子構造解析
研究概要

1.ニトリルヒドラターゼ(NHase)の触媒反応の時間分割X線結晶構造解析。
kcatが約2%に低下する変異体βR56KNHaseを用いて、tert-butyl nitrile(tBuCN)の水和反応を解析した。βR56KNHaseをニトロシル化して不活性化したものを結晶化し、暗所でtBuCNを添加した後、光照射で酵素を活性化し、結晶内で触媒反応を行わせた。一定時間、光条件下で反応させた後、結晶を凍結して反応を停止させ、結晶構造を決定した。反応時間5-120分で解析した結果、tBuCNは反応開始後50分までに非ヘム鉄反応中心に配位したが、その電子密度の形状は基質ではなく、生産物のtert-butyl amideに酷似していた。また、アミド基の酸素原子となる電子密度と酵素のシステインスルフェン酸配位子の酸素原子間の距離は0.7Aであり、両者は同一原子であると考えられた。すなわち、非ヘム鉄中心に配位した基質のニトリル炭素をシステインスルフェン酸配位子の側鎖酸素原子が求核攻撃するという新奇反応モデルを反応中間体の構造に基づいて提案した。
2.類縁酵素であるチオシアネートヒドロラーゼ(SCNase)とNHaseの基質認識機構の違い。SCNase基質ポケット深部に側鎖をもつ二つのArgをNHaseの相当するアミノ酸に置換した変異体(βR90F,γ
R136W)SCNaseを解析した。いずれの酵素もSCNase活性を消失し、弱いNHase活性を示した。γR136WSCNaseの結晶構造を決定したところ、γArg136の置換によって、ポケットのサイズが大きくなり、ポケット表面の正電荷がやや減少していた。以上の結果から、SCNaseにおいては、基質ポケットが小さく、ポケット上部に存在するこれらのArg残基によって、負電荷の基質が捕捉されることが触媒活性に重要であることがわかった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

時間分割X線結晶構造解析により、酵素基質複合体と思われる反応中間体の結晶構造を決定することができ、反応中間体の立体構造に基づく反応機構を世界で始めて提唱することに成功した。今後、提唱したモデルと生化学的に検証することで、反応機構の核心に迫ることができると期待される。一方で、もう一つの鍵である中性子構造解析に関しては、未だ、良質な結晶を作成中であるため、今後、精力的に進めて行く必要がある。

今後の研究の推進方策

時間分割X線結晶構造解析の結果に基づいて提唱した反応モデルを安定同位体を用いて触媒反応を追跡することにより、検証する。一方、中性子構造解析に適用可能な良質な大型結晶の作製を集中して行い、ニトリルヒドラターゼの中性子構造解析を試みる。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (14件)

  • [雑誌論文] Two arginine residues in the substrate pocket predominantly control the substrate selectivity of thiocyanate hydrolase.2013

    • 著者名/発表者名
      Yamanaka Y, Arakawa T, Watanabe T, Namima S, Sato M, Hori S, Ohtaki A, Noguchi K, Katayama y Yohda M, Odaka M.
    • 雑誌名

      J Biosci Bioeng.

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.

    • 査読あり
  • [学会発表] 活性化タンパク質P15Kによるチオシアネート加水分解酵素成熟化機構の解明2012

    • 著者名/発表者名
      渡邉俊則、中西拓也、荒川孝俊、堀祥太、中山洋、片山葉子、堂前直、Gumataotao Natarie、野口恵一、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      第85回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡国際会議場
    • 年月日
      2012-12-16
  • [学会発表] Rhodococcus erythropolis N771由来ニトリルヒドラターゼの触媒機構における必須アルギニン残基の機能2012

    • 著者名/発表者名
      相原敬之、山中保明、野口恵一、中山洋、堂前直、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      第85回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡国際会議場
    • 年月日
      2012-12-15
  • [学会発表] Rhodococcus erythropolis N771 由来一酸化窒素合成酵素及び酸化還元酵素様タンパク質の発現と生化学的解析2012

    • 著者名/発表者名
      北田亜美、前田悠貴、清水敏史、山中保明、大滝証、金城大進、山田和弘、野口恵一、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      第85回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡国際会議場
    • 年月日
      2012-12-15
  • [学会発表] Christal Structure Analysis of the Reaction Intermediate of Nitrile Hyd ratase2012

    • 著者名/発表者名
      Masafumi Odaka, Yasuaki, Yamanaka、Koichi Hashimoto, Keiichi Noguchi, Masafumi Yohda
    • 学会等名
      The 6th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
    • 発表場所
      The Hong Kong Polytechnic University、香港
    • 年月日
      2012-11-05
  • [学会発表] Functions of Two Strictly Conserved Arginine Residues in Fe-type Hydratase from Rhodococcus erythropolis N7712012

    • 著者名/発表者名
      Takayuki Aihara, Yasuaki Yamanaka, Keiichi Noguchi, Masafumi Yohda, Masafumi, Odaka
    • 学会等名
      生命医薬情報学連合大会
    • 発表場所
      Tower Hall Funabori、東京都
    • 年月日
      2012-10-14
  • [学会発表] 変異体を用いたチオシアネート加水分解酵素反応機構の解析2012

    • 著者名/発表者名
      渡邉俊則、山中保明、荒川孝俊.浪間聡志、中山洋、片山葉子、堂前直、野口恵一、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      酵素工学研究会第68回講演会
    • 発表場所
      東京大学山上会館
    • 年月日
      2012-10-05
  • [学会発表] Rhodococcus erythropolis N771 由来一酸化窒素合成酵素及び酸化還元酵素様蛋白質の発現と生化学的解釈2012

    • 著者名/発表者名
      北田亜美、前田悠貴、清水聡史、山中保明、大滝証、金城大進、山田和弘、野口恵一、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      酵素工学研究会第68回講演会
    • 発表場所
      東京大学山上会館
    • 年月日
      2012-10-05
  • [学会発表] ニトリルヒドラターゼファミリーの基質認識機構の違い2012

    • 著者名/発表者名
      相原敬之、佐藤雅、山中保明、渡邉俊則、野口恵一、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      酵素工学研究会第68回講演会
    • 発表場所
      東京大学山上会館
    • 年月日
      2012-10-05
  • [学会発表] ニトリルヒドラターゼ触媒機構の時間分割X線結晶構造解析2012

    • 著者名/発表者名
      山中保明、野口恵一、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      第6回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      北海道大学
    • 年月日
      2012-09-08
  • [学会発表] チオシアネート加水分解酵素の成熟化機構2012

    • 著者名/発表者名
      中西拓也、堀祥太、荒川孝俊、中山洋、片山葉子、堂前直、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場(招待講演)
    • 年月日
      2012-06-22
  • [学会発表] チオシアネート加水分解酵素基質ポケット近傍アルギニン残基の基質特異性への影響2012

    • 著者名/発表者名
      渡邉俊則、山中保明、荒川孝俊、浪間聡志、中山洋、片山葉子、堂前直、野口恵一、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場
    • 年月日
      2012-06-20
  • [学会発表] Corynebacterium sp. N-1074由来Halohydrin Hydrogen-halide-lyaseの構造解析2012

    • 著者名/発表者名
      渡辺文昭、大滝証、湯不二夫、尾高雄文、養王田正文
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場
    • 年月日
      2012-06-20
  • [学会発表] Rhodococcus erythropolis N771 由来一酸化窒素合成酵素及び酸化還元酵素様タンパク質の発現と生化学的解釈2012

    • 著者名/発表者名
      北田亜美、前田悠樹、清水敏史、山中保明、大滝証、金城大進、山田和弘、野口恵一、養王田正文、尾高雅文
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場
    • 年月日
      2012-06-20
  • [学会発表] Difference in the substrate recognition among nitrile hydratase family2012

    • 著者名/発表者名
      Takayuki Aihara, Masa Sato, Yasuaki Yamanaka, Toshinori Watanabe, Keiichi Noguchi, Masafumi Yohda, Masafumi Odaka
    • 学会等名
      12th Japan - China-Korea Joint Symposium on Enzyme Enginnerin
    • 発表場所
      Kanazwa Excel Hotel Tokyu, 石川県
    • 年月日
      2012-05-29

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公開日: 2014-07-16  

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