| 研究課題/領域番号 |
24370045
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
中島 良介 大阪大学, 産業科学研究所, 特任准教授 (20379100)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 蛋白質 / 細菌 / 抗生物質 / 感染症 / 多剤耐性 |
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| 研究概要 |
緑膿菌はしばしば多剤耐性化して臨床の場で問題となっているが、多剤排出タンパクがこの耐性化の主要な原因である。また現状ではこの病原菌に対する有効な治療薬はない。感染症の原因菌である緑膿菌の持つRND型多剤排出タンパク（TolC共役型）MexBの結晶構造を解くことに成功し、次いで特異的阻害剤（ABI-PP）との結合構造の解析にも成功した。これは異物排出トランスポーターオリエンテッドな構造に基づいた創薬の足がかりとなる成果である。この結果、阻害剤が結合する疎水的なピットの存在が明らかとなり、かつ排出タンパクのABI-PP阻害特異性は、その結合ピットの僅かな立体障害の差により決まることが明らかになった(Nature,500,2013)。
多剤排出タンパクMacBは膜融合タンパクMacA、外膜チャンネルTolCと三者複合体を形成して機能する。しかしそのストイキオメトリーの詳細は分かっていない。25年度はMacB単独での結晶構造解析を目指した研究と平行して、複合体の結晶化を見据えて結合量比を解明する研究を行った。MacA、MacBの量比を変えてリンカーでつないだ融合タンパクの構築を目指して、まず1:1の量比の融合タンパクを構築した。Western Blottingにより、設計通りのMacB-linker-MacAが細胞膜に発現していることを確認した。また、MacB-linker-MacA発現株でMICが上昇した事から、融合タンパクが薬剤排出活性を有している事を示した。MacAは六量体の結晶構造が解かれ、これが機能単位であることが示唆されている。またMacBはNBDドメインを持ち、二量体で機能すると考えられている。このことから従来は、MacAとMacBは3: 1の比で結合しているというのが有力であった。今回、MacB-linker-MacA(1:1)が排出活性を示した事から1: 1の比で機能することが新たに判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
MexBと既存の阻害剤(ABI-PP)存在下/非存在下での結晶構造を解くことに成功し、阻害剤の結合様式及び、阻害特異性（ABI-PPはMexBを特異的に阻害するがMexYを全く阻害しない）を決定する要因を解明した。これは異物排出トランスポーターオリエンテッドな構造に基づいた創薬の足がかりとなる成果である。
MacBとMacAが1：1の結合量比で機能しうるという新しい知見は画期的で複合体結晶化に必須な情報を含んでいるばかりでなく、その融合タンパクが直接結晶化に利用できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
25年度中の結晶化条件のスクリーニングでは構造解析に耐えられる良質な結晶の獲得には至らなかった。目的タンパクの断片化という現象が確認され、このことが結晶化の大きな障害になっていることが考えられた。内在性プロテアーゼによる断片化、あるいは強制発現に起因するフォールディングミス後の消化が原因として考えられるが、正確な原因は特定されていない。MacBはホモ二量体で機能する。C末端側が欠落する断片化が生じており、二量対形成に大きく寄与しているN末端NBDドメインを残しているために、断片と全長を分離することが困難である。目的タンパク発現膜画分の調整に当たってプロテアーゼインヒビターの添加では断片化を軽減できないが、発現ベクター/発現ホストの見直しにより断片化の軽減を達成している。引き続き結晶化条件のスクリーニングを行う。
この他、膜融合タンパクMacA存在下ではMacBの断片化を抑えられることを発見した。現在MacAとの共発現系を構築中である。また、MacB-MacA融合タンパクが機能を有することも確かめられたので、MacB単独での結晶化に平行して二者複合体の結晶化にもチャレンジする。
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