| 研究課題/領域番号 |
24370048
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
高橋 栄夫 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 教授 (60265717)
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| 研究分担者 |
竹内 恒 産業技術総合研究所, 創薬分子プロファイリング研究センター, 研究員 (20581284)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 膜タンパク質 / 酵母 / NMR |
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| 研究概要 |
NMR構造解析に供するヒト膜タンパク質試料の調製を目指し、複数の発現系構築を行った。P. pastorisの発現系が構築できた膜タンパク質(AQP1,C99,PMP22,TARPγ-2)については、いずれも酵母膜画分に発現されていることが確認された。PMP22などは大腸菌発現系では膜画分に発現しないことが知られており、本酵母発現系はこれらのヒト膜タンパク質発現に有効であると考えられた。AQP1については、2種類のプロモーター(AOX1,GAP)の発現系を構築し、1L培養あたり10mgを超える試料を調製することが可能となった。NMR試料調製において必要となる最小培地での発現においては収量が減少する問題がみられたが、培養条件、菌体の破砕条件、膜からの抽出条件等についての詳細な検討・至適化を行うことで、NMR構造解析に供する量の試料調製も可能となってきた。
高分子量膜タンパク質のNMR構造解析・相互作用解析に必要となる、高効率な重水素ラベルおよびメチル選択ラベルを酵母発現系において達成するため、酵母K. lactisによるモデルタンパク質(MBP)発現系を用いた条件検討を行った。一般的に重水培養時には生育速度が低下し、発現タンパク質収量が減少したが、前培養での重水に対する馴化、および流加培養法を併用することで収量を増大させることに成功した。
メチル選択ラベルについては、大腸菌とは異なる代謝経路が存在するため、Val、Leuのメチル標識率が低いという事実が判明したが、これを克服する目的で、形質転換時に酵母細胞質内に新たにアミノ酸合成酵素を共発現させる試みを行ったところ、顕著な標識率の向上が見られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
モデルタンパク質を用いた酵母発現系による安定同位体ラベリング技術の開拓については、重水培養における生育改善、メチル選択ラベルにおける問題点の発見とその克服方法を確立できたことから、おおむね順調に進展していると考えている。一方、ヒト膜タンパク質の酵母発現に関しては、その発現量が顕著に低下する問題に遭遇した。
培養条件、試料精製過程等について、時間をかけて詳細な見直しを行った結果、最近になり複数種の膜タンパク質について構造解析に供する試料量を発現することも可能となってきた。当初予定していたミトコンドリア内膜トランスポーター群の発現については未だ実施できておらず、次年度対応していく予定であるが、発現が可能となった膜タンパク質がすでに複数あるため、そのNMR構造解析への進展を優先して行おうと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、構造解析可能な発現量を示したヒト膜タンパク質のNMR構造解析へととりかかるが、最終的な収量が十分でない膜タンパク質については、(1)コドンの最適化による発現量増大、(2)酵母発現株の検討、(3)ファーメンター培養条件の見直し、(4)試料精製段階でのロスを防ぐための方策(タンパク質分解酵素阻害剤の検討)、(5)界面活性剤による抽出方法の再検討、などの対応により収量増大を目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
酵母発現系における各種ヒト膜タンパク質発現の際、最小培地における培養時、さらには重水培養時に発現タンパク質収量が低下する問題があり、その解決に時間を要したことから、コストがかかる安定同位体ラベルした各種膜タンパク質試料の大量調製には至っていない。次年度はNMR構造解析に供する試料の大量調製のための安定同位体ラベル試薬に加え、他の培養関連試薬、精製関連試薬(界面活性剤、酵素阻害剤等)の購入を必要とする。また、さらに研究を加速するための研究補助員費に経費を割り当てる予定。
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