研究課題
本申請では、転写基本因子TFIIDのTAF1サブユニットのHATドメイン（TAF1HAT）と、TAF7サブユニットの複合体の(1)結晶構造解析と(2)機能解析という目標を立て、平成24年度は、大腸菌におけるリコンビナントタンパク質の大量精製法の確立と、安定同位体ラベルしたタンパク質を用いたNMR測定を行った。その結果、TAF7は単独では明確な立体構造を形成せず、立体構造維持には何らかの相互作用因子が必要であることが示唆された。平成25年度は、TAF7の立体構造を安定化するための様々な相互作用因子（TAF1のユビキチン様ドメイン・HATドメイン・HAT-E1E2ドメイン・HAT-E1E2- RAPID-HMGドメイン・E1E2-RAPID-HMGドメイン・RAPID-HMGドメイン・HMGドメイン）の精製の準備を進めてきた。平成26年度は、TAF1, TAF7の精製と結晶化を進めると同時に、TAF1HAT-TAF7複合体の機能解析を行うための実験系の立ち上げを行った。TFIIDはプロモーターDNA上に分子集合して機能することから、プロモーターDNA上に、TAF1, TAF7を含む転写関連複合体を分子集合させることを試みた。まず、TFIIDのDNA結合サブユニットであるTBPを精製し、さらにTBPのDNAへの結合を安定化するTFIIB, TFIIAを精製した。TFIIBはシングルポリペプチドなので、大腸菌で単独で発現させて精製した。TFIIAについては2サブユニットの因子であるためか、サブユニット単独では大腸菌内では全く可溶化しない。そこで、TFIIAの2 subunitを融合して発現させるコンストラクトを作製し、発現・精製した。精製タンパク質とプロモーターDNAを順次混合して、TBP-DNA-TFIIBが複合体を形成することを確認した。
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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Biochem. J.
巻: 462 ページ: 257-265
10.1371/journal.pone.0092249.
http://pfweis.kek.jp/index.html
