力学的刺激によるRhoファミリーの活性化とアクチン骨格制御機構

2012 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24370051
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 水野 健作 東北大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (70128396)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 細胞・組織 / 細胞骨格 / 細胞極性 / メカノセンサー

研究概要

細胞はメカニカルストレスに応答して、形態、極性、接着性、運動能、増殖能を大きく変化させるが、力学的シグナルを化学的シグナルに変換する分子機構の多くは不明である。Rhoファミリーは、アクチン骨格の再編成を誘導し、力刺激依存的な細胞応答を制御する中心的役割を担っている。本研究では、(1)ヒト血管内皮細胞(HUVEC)の繰返し伸展刺激によるストレスファイバーの再配向、(2)3次元培養下におけるヒト乳腺上皮MCF-10A細胞の細胞外基質の硬さの増加によるシスト(嚢胞)形成の脱組織化、を細胞の力覚応答のモデル系として用い、メカニカルストレスによるRhoファミリーの活性化(特にRhoファミリー活性化因子であるRho-GEFの活性化)の分子機構とアクチン骨格の制御機構を解明することを目的として研究を行い、以下の結果を得た。ヒトゲノム中に存在するDblファミリーに属する69種類のRho-GEFに対するshRNAライブラリーを作製し(FEBS Lett. 2013)、Rho-GEF発現抑制効果の網羅的解析を行った結果、(1)に関与する8種のRho-GEFと、(2)に関与する5種のRho-GEFの同定に成功した。同定した各Rho-GEFについて、各細胞での発現をRT-PCRにより確認した。また、Halo-tagを付加したRho-GEFを発現する細胞株を作製し、プロテオーム解析により結合蛋白質を探索し、数種の特異的結合蛋白質の同定に成功した。これらの結合蛋白質とRho-GEFが細胞内局所で共局在することを見出した。現在は、さらに、Rho-GEFの上流、下流のシグナル伝達機構とアクチン骨格の動態の解析を進めている。また、私達が開発したs-FDAP法を用いて、メカニカルシグナルに応答して、細胞内アクチン単量体濃度が急速に上昇することを明らかにした(NCB 2013)。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Rho-GEFに対するshRNAライブラリーを作製し、(1)血管内皮細胞の繰返し伸展刺激によるストレスファイバーの再配向、(2)3次元培養下における乳腺上皮細胞の細胞外基質の硬さの増加による嚢胞形成の脱組織化、の二つの力覚応答に関与するRho-GEFの同定に成功した。これらの同定したRho-GEFの結合蛋白質の同定にも成功しており、メカニカルストレス依存的なRho-GEFの活性化に関わる分子機構の解析が進んでいる。また、力学的刺激に応答してアクチン単量体濃度が上昇することを明らかにした。
以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

力学的刺激に対する細胞応答に関与するRho-GEF及びその結合蛋白質の同定に成功したので、今後は、Rho-GEFの標的となるRhoファミリーの同定、力学的刺激依存的なRho-GEFの活性、局在、リン酸化レベル、結合蛋白質、立体構造の変化を解析する。これらの結果に基づいて、力学的シグナルを化学的シグナルに変換する分子機構、力学的刺激によるアクチン骨格の再構築制御機構を解明することが今後推進すべき課題である。

次年度の研究費の使用計画

H24年度は、国外の学会に参加しなかったことと、謝金を使用しなかったため、当該助成金が生じた。
次年度の研究費とあわせて、研究の遂行に必要な細胞培養用試薬等の消耗品の購入費、国外・国内の学会参加費、論文投稿費等に使用する。

研究成果

• [雑誌論文] p63RhoGEF-mediated formation of a single polarized lamellipodium is required for chemotactic migration of breast carcinoma cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hayashi, A., Hiatari, R., Tsuji, T., Ohashi, K., and Mizuno, K.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 587 ページ: 698-705
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.01.043.
  • 査読あり
• [雑誌論文] NDR2-mediated Rabin8 phosphorylation is crucial for ciliogenesis by switching binding specificity from phosphatidylserine to Secl5. (2013)
  • 著者名/発表者名: Chiba, S., Amagai, Y., Homma, Y., Fukuda, M., and Mizuno, K.
  • 雑誌名: EMBO J. 巻: 32 ページ: 874-885
  • DOI: 10.1038/emboj.2013.32.
  • 査読あり
• [雑誌論文] F- and G-actin homeostasis regulates mechanosensitive actinnucleation by formins. (2013)
  • 著者名/発表者名: Higashida, C., Kiuchi, T., Akiba, Y., Mizuno, H. Maruoka, M., Narumiya, S., Mizuno, K.
  • 雑誌名: Nat. Cell Biol. 巻: 15 ページ: 395-405
  • DOI: 10.1038/ncb2693.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Signaling mechanisms and functional roles of cofilinphosphorylation and dephosphorylation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mizuno. K.
  • 雑誌名: Cell. Signal. 巻: 25 ページ: 457-469
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2012.11.001.
  • 査読あり
• [雑誌論文] beta-arrestin-dependent regulation of the cofilin pathway is required for the scavenging activity of the atypical chemokine receptor D6. (2013)
  • 著者名/発表者名: Borroni, E. M., Cancellieri, C., Vacchini, A., Benureau, Y., Lagane, B., Bachelerie, F., Arenzana-Seisdedos, F., Mizuno, K., Mantovani, A., Bonecchi, R., and Locati, M.
  • 雑誌名: Sci. Signal. 巻: (in press)(掲載確定)
  • 査読あり
• [雑誌論文] CaMKIIbeta-mediated LIM-kinase activation plays a crucial role in BDNF-induced neuritogenesis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Saito, A., Miyajima, K., Akatsuka, J., Kondo, H., Mashiko, T., Kiuchi, T., Ohashi, K., and Mizuno. K.
  • 雑誌名: Genes Cells 巻: (in press)(掲載確定)
  • DOI: 10.1111/gtc.12054
  • 査読あり
• [雑誌論文] Coactosin accelerates cell dynamism by promoting actin polymerization. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hou, X., Katahira, T., Ohashi, K., Mizuno, K., Sugiyama, S, and Nakamura, H.
  • 雑誌名: Dev. Biol. 巻: (in press)(掲載確定)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Visualization of cofilin-actin and Ras-Raf interactions by bimolecular fluorescence complementation assays using a new pair of split Venus fragments. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohashi, K., Kiuchi, T., Shoji, K., Sampei, K., and Mizuno、 K.
  • 雑誌名: BioTechniques 巻: 52 ページ: 45-50
  • DOI: 10.2144/000113777.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cytochalasin D acts as an inhibitor of the actin-cofilin interaction. (2012)
  • 著者名/発表者名: Shoji, K., Ohashi, K., Sampei, K., Oikawa, M., Mizuno. K.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 424 ページ: 52-57
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.06.063
  • 査読あり
• [雑誌論文] Furry protein promotes Aurora A-mediated Polo-like kinase lactivation. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ikeda, M., Chiba, S., Ohashi, K., and Mizuno, K.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 287 ページ: 27670-27681
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.378968.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel PKCa-mediated phosphorylation site(s) on cofilin and their potential role in terminating histamine release. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sakuma, M., Shirai, Y., Yoshino, K., Kuramasu, M., Nakamura, T., Yanagita, T., Mizuno. K.. Hide, I., Nakata, Y., and Saito, N.
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 23 ページ: 3707-3721
  • DOI: 10.1091/mbc. E12-01-0053
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cancer susceptibility and embryonic lethality in MoblA/lB double mutant mice. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nishio, M., Hamada, K., Kawahara, K., Sasaki, M., Noguchi, F., Chiba, S., Mizuno. K.. Suzuki, S. 0., Dong, Y., Tokuda, M. Morikawa, T., Hikasa, H. Eggenschwiler, J., Yabuta, N., Nojima, H., Nakagawa, K., Hata, Y., Nishina, H., Mimori, K., Mori, M., Sasaki, T., Mak, T. W., Nakano, T., Itami, S., and Suzuki, A.
  • 雑誌名: J. Clin. Inv. 巻: 122 ページ: 4505-4518
  • DOI: 10.1172/JCI63735.
  • 査読あり
• [学会発表] Identification of Rho-GEFs involved in mechano-biological responses of vascular endothelial cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ohashi K., Abiko H., Kondo H., Fujiwara S., Mashiko K., Sakamoto N., Sato M., and Mizuno K.
  • 学会等名: International Symposium on Biomedical Engineering Interface
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 20130314-20130315
• [学会発表] Db1ファミリーRho-GEFであるCDEPは乳腺上皮細胞の細胞外マトリックスの硬さ依存的な形質転換に関与する (2012)
  • 著者名/発表者名: 高橋将太、大橋一正、北谷佳那恵、直塚萌、佐藤圭一、阿部彰子、萱場敦子、梶紀子、水野健生
  • 学会等名: 第85回日本生化学会大会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20121214-20121216
• [学会発表] Identification of Rho-GEFs Involved in Cyclic Stretch-induced Mechanosensing of Vascular Endothelial Cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Kondo, Kazumasa Ohashi, Hiyori Abiko, Ryuichi Hiatari, Naoya Sakamoto, Masaaki Sato, Kensaku Mizuno
  • 学会等名: 第35回日本分子生物学会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20121211-20121214
• [学会発表] Identification of Rho-GEFs involved in mechanosensing of vascularendothelial cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Kondo, Kazumasa Ohashi, Hiyori Abiko, Ryuichi Hiatari, Naoya Sakamoto, Masaaki Sato.Kensaku Mizuno
  • 学会等名: 第45回日本発生生物学会・第64回日本細胞生物学会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 20120528-20120531
• [学会発表] アクチン過渡的複合体形成のダイナミクスと細胞運動 (2012)
  • 著者名/発表者名: 水野健作
  • 学会等名: 第12回日本蛋白質科学会年会、ワークショップ「過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理
  • 発表場所: 名古屋(招待講演)
  • 年月日: 2012-06-20