| 研究課題/領域番号 |
24370062
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
飯野 亮太 東京大学, 大学院・工学系研究科, 講師 (70403003)
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| 研究分担者 |
五十嵐 圭日子 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 准教授 (80345181)
内橋 貴之 金沢大学, 数物科学系, 准教授 (30326300)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 1分子計測・操作 / キチナーゼ / セルラーゼ / モータータンパク質 |
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| 研究概要 |
1.光学顕微鏡の時間分解能・位置決定精度の向上
55マイクロ秒の時間分解能で1nmの位置決定精度、および1マイクロ秒の時間分解能で2nmの位置決定精度を達成する全反射型暗視野光学顕微鏡システムを構築した。可視化プローブとして前者は直径40nm、後者は直径80nmの金コロイド粒子を用いた。
2-1分子計測用キチナーゼ、セルラーゼ変異体調製と生化学的評価
大腸菌での遺伝子組み変えおよび発現が確立しているBacillus circulans由来のキチナーゼを用い、精製用のHisタグや、可視化プローブを結合させるビオチンタグを導入するためのシステイン残基を導入した変異体を多種類作製した。さらに運動方向が異なる別ファミリーについても同様に1分子計測用変異体を作製した。さらに、Trichoderma viride由来のセルラーゼの変異体作製も行った。作製したシステイン導入変異体を発現・精製し、ビオチン導入効率が高い、可視化プローブとの結合効率が高い、結晶性多糖への吸着活性や分解活性等が野生型と同程度である、といった基準でスクリーニングを行った。さらにキチナーゼについては、蛍光1分子観察で運動を可視化することにも成功した。
3.高速AFMによるキチナーゼおよびセルラーゼ変異体、キチン、セルロース試料の評価
キチナーゼ、セルラーゼの各種変異体を高速子間力顕微鏡(AFM)で観察し、移動速度が野生型に比べどのように変化するかを調べた。特にHisタグやビオチンタグ導入による移動速度の低下がないことを確認した。また、生化学的な分解活性の結果と比較した。また、アンモニア処理により結晶性を変化させた多糖を用いて高速AFM観察を行い、移動速度の変化を評価した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1分子計測用のキチナーゼ、セルラーゼ変異体作製が完了し、機能の保持を確認できた。また、1分子蛍光観察や高速AFM観察で運動を可視化することにも成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
作製したキチナーゼ、セルラーゼ変異体を用い、金コロイドやラッテクスビーズをプローブとする高時間・高空間分解能1分子計測を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当該助成金が発生したのは変異体作製がスムースに進み、当初の計画よりも少ない種類の作製で1分子計測に適したものを得ることが出来たためである。試料調製のための培養試薬、タンパク質ビオチン化試薬、光学部品等、翌年度の1分子計測を迅速に進めるための消耗品費として用いる予定である。
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