| 研究課題/領域番号 |
24370063
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
富重 道雄 東京大学, 大学院・工学系研究科, 准教授 (50361530)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 分子モーター / 生物物理 / 一分子計測(SMD) / ナノマシン / 細胞内輸送 |
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| 研究概要 |
本研究は、分子モータータンパク質キネシンが微小管上を二足歩行運動する仕組み、特に2つの頭部をつなぐネックリンカーが頭部間の協調性を生み出す仕組みを明らかにすることを目的とする。本年度は、微小管から解離した頭部が前方の結合部位に選択的に結合するプロセスを詳しく調べるために、片方の頭部の運動を従来よりも200倍高い時間分解能で観察する手法の開発を行った。従来の蛍光色素を用いたナノ計測法では色素の退色の問題で、時間分解能を10ミリ秒程度までしか上げることができなかった。そこで光をよく散乱する金コロイド粒子で片方の頭部を標識し、野地等によって開発された全反射型暗視野顕微鏡(Ueno et al. 2010)で観察したところ、片方の頭部の運動を50マイクロ秒の時間分解能および2nmの位置検出精度で検出することに成功した。頭部につけた金コロイド粒子は進行方向に向かって16nmステップを示し、またステップが起きる直前に位置のゆらぎが大きく上昇する様子が観察された。このようなゆらぎの2状態遷移は従来の時間分解能が低い測定では観察することができなかったものである。位置ゆらぎの上昇はキネシンの頭部が微小管から解離してブラウン運動することによるものであり、この方法によって頭部が微小管に結合した状態と解離した状態を区別して検出することに初めて成功した。解離した状態の頭部のゆらぎは等方的ではなく、結合サイトから右側に偏った位置で揺らいでいた。これはキネシンのネックリンカーが頭部の右側から伸びているという構造上の特徴に由来するものである。また頭部が浮いた状態を取る時間は溶液中のATP濃度に依存し、ATP濃度を下げるにつれて解離した状態をとる時間が長くなった。これはATP結合を待っている状態は片足を浮かせた状態であることを裏付けるものである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初の研究計画にはなかった暗視野顕微鏡を使ったキネシンの運動計測を試したところ、従来の手法よりもはるかに高い時間分解能での一分子計測が可能となった。この方法を用いることによってキネシン頭部の運動中の振る舞いや各ステップの時定数を精密に計測することができるようになり、研究目的を達成するための基盤技術の開発が予想以上に進んだため。
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| 今後の研究の推進方策 |
暗視野顕微鏡装置を用いた高時間分解能計測法により、キネシンのネックリンカーを伸ばした変異体や2つの頭部をタンデムにつなげた変異体の運動を計測を行って、ネックリンカーへの張力が頭部間の協調性に与える影響を調べる。さらに一分子FRET法を用いて前後の頭部へのATP結合の可視化を行うことにより、ネックリンカーの張力〓向きによるATP加水分解の制御の仕組みを調べる.
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| 次年度の研究費の使用計画 |
暗視野顕微鏡観察は東大・工・応用化学専攻野地研究室の装置を借りて行ったため、当年度は装置開発に関わる支出を行わずにその分の繰越額が生じた。本年度は当研究室の顕微鏡を改良して暗視野顕微鏡観察を行うための光学部品の購入や研究で用いる変異体キネシン作製のための遺伝子組み換え・タンパク質精製のための試薬の購入、また変異体作成を遂行するための実験補助員の雇用に充てる。
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