| 研究課題/領域番号 |
24370064
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
養王田 正文 東京農工大学, 大学院・工学研究院, 教授 (50250105)
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| 研究分担者 |
関口 博史 高輝度光科学研究センター, 利用研究促進部門, 研究員 (00401563)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | シャペロニン / シャペロン / フォールディング / 古細菌 / 構造変化 |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、超好熱性古細菌Thermococcus sp. strain KS-1由来グループII型シャペロニン(CPN)のリング間及びリング内サブユニット協調作用機構解明を目的である、本年度は、非対称CPN(CPN^<ASR>)及びリング内に変異を含むCPNを構築し、機能解析を行った。
リング間の協調作用機構解明を目的に、循環置換型連結CPN(CPN^<cpc>)を用いて,野生型サブユニットで構成されたリングと変異型サブユニットのリングからなるCPN^<ASR>の構築と機能解析を行った。CPN^<cpc>は2個のサブユニットを連結し,そのN末端95アミノ酸残基を削除してC末端に付加した変異体である。ArPase活性欠損サブユニットから構築したCPN^<cpc>と野生型サブユニットを共発現させ、CPN^<ASR>を構築した。CPN^<ASR>は十分な基質捕捉能を有しているにも関わらず、フォールディング活性の低下が見られた。また,ATPase活性は野性型の約50%の活性を保持していた。さらに、時分割X線回折追跡法による解析を行い、野生型と同様にATP依存的ねじれ運動を検出した。この結果から、リング間の協調作用は存在するが、不可欠ではないことが示唆された。さらに、リング内の協調作用機構解明を目的に、ループ領域にTrpを導入したL56W変異体と、ATP依存的な構造変化が起こらないArP加水分解活性欠損体を連結させたCpn(FA)_8を作製した。L56W変異体はclosedへ構造変化するとTrpの蛍光強度が増大する。Stopped-flow装置を用いた経時的な構造変化解析では、L56wホモオリゴマーと同様にArp濃度依存的に蛍光強度が増大し、構造変化することが確認された。しかし、L56Wホモオリゴマーに比べCpn(FA)_8の構造変化速度は遅かった。この結果は、ATP依存的に構造変化できないサブユニットが、隣接した野生型サブユニットの効果により構造変化したことを示している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
循環置換型連結CPNの構築が困難であると予想されたが、設計に成功し、予想よりも早く構築することができた。その結果、非対称CPNの構築と機能解析を予定よりも早く実施することが可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
循環置換型連結CPNの他に8連結体を用いた非対称CPNの構築を行い、2種類の非対称CPNの機能を比較することで、リング間協調作用機構を解明する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度はほとんど予定通り予算を執行したが、購入した試薬などの価格の変動によりわずかな剰余金が発生したので、次年度使用することとした。予算執行計画は当初の計画と同じである。
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