研究課題
基盤研究(B)
本研究は、張力によるアクチンフィラメントの構造変化を解明し、さらにそうした構造変化によるミオシン結合量の増加ならびに細胞内局在変化するかを検証するために、大別して三つのサブテーマに分かれた実験を行い、最終的にそれらの結果を総合的に解釈してメカノセンサーとしてのアクチンフィラメントの機能とそれによるミオシン機能の制御システムの理解を目指す。それぞれのサブテーマの目標と昨年度の進捗は以下の通りである。1.目標:in vitroでアクチンフィラメントに張力を負荷し、それによってミオシンモータードメインの結合量が増えることを実証するとともに、構造変化を引き起こすのに必要な力を見積もる。進捗:力を負荷するための伸縮性基板上でアクチンフィラメントを共焦点蛍光観察できる目処が立った。2.目標:張力負荷時にアクチンフィラメントにどのような構造変化が起きるかを予測し、それを検出できるような蛍光プローブを開発して、in vitroおよびin vivoでプローブの蛍光変化を検出する。進捗:MDシミュレーションにより、力負荷により構造変化するアクチン内の残基を予想することができたので、それに基づいて、蛍光プローブアクチンの設計に着手した。また蛍光プローブアクチンを発現するための発現系の整備を行った。3.目標:細胞内のアクチンフィラメントにどの程度の張力がかかっているかを見積もり、in vitroで構造変化を起こすのに必要と見積もられた力と比較する。進捗:細胞底面にかかる牽引力を測定するための微小ピラー列を作製し、培養のための条件検討を始めた。
2: おおむね順調に進展している
研究概要で述べた三つのサブテーマのうち、1番と2番は順調に進捗している。とくに2番のサブテーマで、張力負荷により構造が変化すると予想されるアクチン内残基が特定されたことは大きな進歩である。これに対して3番のサブテーマはやや進捗が遅れており、何らかの対策が必要である。
各サブテーマは、以下のように推進する。1.ATP存在下でアクチンフィラメントに結合させたGFP-プローブS1を共焦点顕微鏡で可視化できるかどうかを検証し、可視化できた場合は予定通り張力負荷実験に進む。可視化できなかった場合は、研究計画にも記載したとおり、FRET系の開発を急ぐ。2.当初予定通り、MDシミュレーションの結果に基づき蛍光プローブアクチンの作製を進め、上記張力負荷系で評価する。3.現在は、シリコンエッチングにより微小ピラー列を作製しているが、この方法が良いかどうかについて早い段階で見極めをつけ、変更が必要と判断され場合は、PDMS法を試みる。
シリコンエッチングにより微小ピラー列の作製が当初予定より遅れており、そのため、当該ピラー列を使った実験に要する経費を次年度において使用する予定である。
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