2012 年度実績報告書

スフィンゴシン1-燐酸輸送体Spns2の哺乳類での機能

研究課題

研究課題/領域番号	24370084
研究種目	基盤研究(B)
研究機関	独立行政法人国立循環器病研究センター
研究代表者	望月直樹独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (30311426)
研究分担者	中嶋洋行独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 研究員 (10467657)
研究期間 (年度)	2012-04-01 – 2015-03-31
キーワード	蛋白質 / 遺伝子 / 動物
研究概要	血管内皮細胞を含めた血管系でのスフィンゴシン1-燐酸(S1P)分泌の意義の解明とS1Pトランスポーター Spns2の機能の解明が本研究の目的である。既に1oxP/creシステムで組織特異的なCre発現マウスとの交配が可能なconditionalノックアウトマウスの作製が可能な状態にある。まずは、リンパ管特異的に発現するCreマウスとの交配により、リンパ管でのSpns2の役割、S1Pの機能を明らかにする実験を開始した。 Spns2が血管腔外に向けてS1Pを分泌することがリンパ臓器からのリンパ管の血管への移行に必須であることを明らかにしたが、Spns2が実際にどこで発現しているのかは不明である。このために、Spns2の抗体を作製することを計画した。NS1細胞に、EGFP-Spns2を安定に発現する細胞を用いて、マウスを免疫して得られた抗体の特異性と感度を確認した。血管内皮細胞のwestern blotを行ったところ、約40kDaに免疫陽性バンドを検出した。血管細胞だけではなく、HEK293細胞でも検出できたことから、内皮細胞以外の細胞・臓器でのSpns2の機能が生体では重要である可能性が示唆された。また、免疫染色で血管内皮細胞の発現部位を検討中であり、もし特異的局在が認められた場合には、免疫電顕による局在変化も調べる計画である。 S1PがS1P受容体を活性化してさらに核内の転写活性化因子Yap1の核内移行を促進することが報告され、我々もSpns2の機能抑制ゼプラフィッシュでの二股心臓の原因の解明をシグナルの解析により行った。内胚葉で特異的にYap1を発現すると二股心臓が回避されることから、Spns2により細胞外に出たS1Pが内胚葉に発現するS1p受容体を活性化して、さらに同胚葉でのYap1依存性の転写を行うことが心臓の正中線への移動に重要であることを突き止めた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初計画では、臓器特異的なSpns2の機能阻害実験を先行することで計画を建てていたが、抗体ができる可能性があり、発現部位の高いところから臓器特異的欠損マウスを作製することが目標達成の近道と考えて、抗体による組織学的検討を優先させた。
今後の研究の推進方策	Spns2の組織特異的ノックアウトマウスの作製による生体での機能の解明のためには、発現部位の検討が優先されるべきであり、さらに発現の高い組織での遺伝子破壊マウス作製が良いと判断した。生体内でのSIPの濃度がnM-μMと報告されており、血管腔内へのSIPの輸送もSpns2が担っている可能性を考え、細胞での詳細な局在検討も重要であると考えた。
次年度の研究費の使用計画	当初予定の消耗品の価格が安くなったために余剰金が発生した。尚、この金額は次年度マウス購入飼育に充てる予定である。