研究課題
小脳は円滑な運動学習のみならず、認識・感情・学習などの高度な神経活動にも関与している。本研究ではゼブラフィッシュとメダカを用いて、小脳神経回路形成過程を制御する分子メカニズムを解明することを目的として実験を行い、下記の結果を得た。１．ゼブラフィッシュを用いた神経回路ライブイメージング：顆粒細胞・プルキンエ細胞・投射神経・登上線維ニューロン特異的に改良型転写活性化因子Gal4(GFF)を発現するトランスジェニックフィッシュ(Tgを)単離した。Gal4依存性のレポーターTgと交配し、個々のニューロンの樹状突起および軸索投射先の詳細な解析を行った。また、Gal4依存性に神経回路を多蛍光で識別できるTg系統を作製した。２．ゼブラフィッシュとメダカと用いた小脳神経回路形成の分子機構の解明：（１）IV型コラーゲンを介した顆粒細胞軸索形成機構の解明：基底膜を構成するIV型コラーゲンの遺伝子collagen4a6およびcollagen4a5の変異体は、顆粒細胞の軸索走行異常を示す。また基底膜形成に関与するFibronectin1およびその受容体Integrin5aの変異体においても、同様に顆粒細胞軸索走行異常を示す。これらのことから、基底膜の形成が顆粒細胞軸索形成に重要な役割を果たしていることを見出した。また、レーザー照射軸索破壊実験から、顆粒細胞のパイニア軸索と基底膜の会合が重要である可能性が示唆された。（２）Contactin1による小脳神経回路形成機構：失調様行動異常を示すメダカ変異体roの原因遺伝子としてcontactin1bを同定した。TALEN法を用いてゼブラフィッシュcontactin1a/1b変異体の作製を行い、contactin1b変異体が運動失調を示すことを明らかとした。（３）遺伝子プロファイリング解析：１のTgを用いて、種々の小脳神経回路ニューロンからRNAを回収し、RNA sequencingを行った。
3: やや遅れている
１．ゼブラフィッシュを用いた神経回路ライブイメージング：目的とする顆粒細胞およびプルキンエ細胞の可視化に成功し、期間内の詳細な解析の目処がついた。一方、登上線維に関しては、可視化できるシステムの作製に成功したものの、トポグラフィックマップの解析等に関して遅れが見られる。２．ゼブラフィッシュとメダカと用いた小脳神経回路形成の分子機構の解明：（１）IV型コラーゲンを介した顆粒細胞の軸索形成に関しては、当初予想していた軸索ガイダンス分子や顆粒細胞側のIntegrinシグナルの関与に関して否定的なデータが得られたため、そのメカニズムの解析に遅れが見られる。（２）メダカro変異体の責任遺伝子としてcontactin1bが確定したが、神経回路に大きな変化を見出せていない。一方、ゼブラフィッシュのcontactin1a/bの変異体作製は順調に行われた。（３）遺伝子プロファリング解析：RNA sequencingのデータが得られるのに少し時間がかかったが、概ね順調であると言える。
１．ゼブラフィッシュを用いた神経回路ライブイメージング：小脳神経回路ニューロン特異的Gal4系統とレポーター系統を交配し、シングルセルレベルの解析を行う。また、多蛍光レポーター系統を用いた解析も平行して行う。２．ゼブラフィッシュとメダカと用いた小脳神経回路形成の分子機構の解明：（１）IV型コラーゲンを介した顆粒細胞の軸索形成に関しては、顆粒細胞軸索と基底膜との相互作用に関して詳細な実験を行う。また、顆粒細胞軸索に関してパイオニア軸索の関与を詳細に解析する。また、顆粒細胞に発現するガイダンス分子の候補を見出しており、Crispr/Cas9法を用いた遺伝子破壊を行い関与を解明する。（２）Contactin1に関しては、ゼブラフィッシュcontactin1a/bダブル変異体の解剖学的・発生生物学的解析を行い、Contactin1ファミリー分子の神経回路形成における役割を解明する。（３）遺伝子プロファイリング：RNA sequecingから得られた情報をin situ hybridizationで確認し、神経回路形成に関与する可能性の高い遺伝子に関して遺伝子破壊を行い、その遺伝子の神経回路形成における役割を明らかにする。
ゼブラフィッシュを用いた神経回路のイメージングに関して、登上線維の解析が遅れが出ている。また、小脳神経回路形成の分子機構に関して、遺伝子プロファイリングの結果が得られるのが若干予定より遅れたため、in situ hybridizationによる遺伝子発現解析や機能解析が次年度に持ち越されたため。１．ゼブラフィッシュを用いた神経回路のライブイメージング：遅れた登上線維形成に加えて解析中の顆粒細胞軸索・プルキンエ細胞の樹状突起形成のライブイイメージングを行うため、顕微鏡関係の消耗品に使用する。また、データの正当性を詳細に解析するため、免疫染色を行う必要があり、組織学的解析に使用する。２．小脳神経回路形成の分子機構の解明：IV 型コラーゲン変異体、contactin1a/b変異体の解析は、主に免疫染色による解析が中心となる、組織学的解析を中心に研究費を使用する。RNA sequencingによって得られた遺伝子プロファイリングの情報を基に遺伝子解析を行うが、神経回路形成を制御する候補遺伝子に関して、in situ hybridization解析、Crispr/Cas9法による遺伝子破壊実験を行い、研究費はこれらの実験を遂行するために使用する。
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PLoS Genetics
巻: 10 ページ: e1004246
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