イネの生活環とオートファジー

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24380037
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 石田 宏幸 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (60312625)
• 研究分担者: 牧野 周 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (70181617)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: オートファジー / イネ / 葉緑体

研究概要

本研究は、イネのライフサイクルにおいて、細胞内タンパク質分解システム・オートファジーが果たす役割について明らかにすることを目的とし、その成果を基盤に米の生産性や品質のさらなる向上に向けた応用研究の展開を目指すものである。より具体的には、逆遺伝学的に同定したオートファジーに必須の遺伝子（autophagy-related gene; ATG）を欠損するイネ変異体の一生、すなわち発芽、成長、生殖、登熟、の各段階における表現型とその要因について、生理・生化学および形態・細胞生物学の主に2つの方向からプロファイリングを行う。それらを手がかりにオートファジーがイネの作物としての重要形質にどのように寄与しているのかについて分子・細胞レベルで明らかにしていく。今年度は主に以下の2項目について解析を進めた。
（1）栄養成長期におけるオートファジーの役割
オートファジー関連遺伝子OsATG7の欠損変異体（Osatg7-1）は、低窒素栄養条件になるほど野生体に比べ成育が低下した。またOsatg7-1では老化葉でのRubiscoや主要な可溶性タンパク質の分解が遅延し、個体内の窒素転流が抑制された。蛍光タンパク質（GFP-ATG8、RFP-ATG8、RBCS-GFP、及びRBCS-RFP）を用いたイネにおけるオートファジーやRCBの可視化・評価系を構築した。
（2）発芽時の貯蔵タンパク質の分解とオートファジー
発芽過程の種子の解析において、種子タンパク質の分解には野生型とOsatg7-1で差は無く、種子タンパク質分解に、オートファジーの明確な関与は認められなかった。その一方で、WTの乾燥種子、発芽初期の種子でOsatg7 mRNAが検出され、種子の発芽初期にオートファジーが機能している可能性が高いことが示された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究では、イネの一生、すなわち発芽、成長、生殖、登熟、の各段階においてオートファジーが果たす役割について、明らかにすることが目的である。これまでにオートファジー関連遺伝子の欠損変異体を単離し、その各段階における表現型について解析を進めてきた。生殖過程については、Osatg7-1では、オートファジーが機能しなくなることで出穂時期が遅れること、さらには花粉や葯の発達が不完全となり雄性不稔となることを明らかにした。さらに栄養成長においては、Osatg7-1の葉では主要なタンパク質の分解や窒素転流が滞り、個体の窒素利用効率や乾物生産が低下することを明らかにした。また今年度は蛍光タンパク質を用いてイネにおけるオートファジーやRCBの可視化・評価系を構築することができた。これらの知見は今後の解析の重要な基盤となるものであり、現時点では目的の達成に向けて着実な成果が得られていると判断される。

今後の研究の推進方策

イネのオートファジー欠損変異体は雄性不稔の表現型を持ち、米が実らないことが分かった。この結果はオートファジーがイネの一生のうち少なくとも出穂前の栄養成長と生殖過程において重要な役割を果たしていることを示唆している。それと同時に、オートファジーの登熟過程における重要性をも示唆するものである。しかしOsatg変異体では炭素や窒素のシンクとなるコメ（胚や胚乳）が形成されないため、これらの変異体ではオートファジーの欠損がシンク－ソースの相互関係のうえに成り立つ登熟過程での光合成機能の維持や窒素転流に及ぼす影響について調べることはできない。今後、イネの登熟過程でのオートファジー役割について明らかにするためには、ATG遺伝子の欠損変異体に代わる研究材料の整備が課題である。具体的には、時期特異的にATG遺伝子の発現を抑制するRNAi形質転換体の作出などが必要であるが、これらは本研究課題の予算立てや残りの研究期間を勘案すると厳しい状況もあり、今後の発展的な研究課題として推進していく道も考えられる。また、発芽過程の問題としては、Osatg7-1は不稔であるため、その種子は変異ヘテロ型・ATG7(+/-)の個体から得た種子をPCR法による遺伝子型選抜を経て解析に使用している。よってOsatg7-1の種子には親個体に由来するATG7 mRNAが蓄積しており、発芽初期の段階では完全にオートファジーが欠損している確証はない。よって発芽過程についてもより確かな結果を得るためには、次年度以降に新たな研究材料の整備が重要になると考えられる。

次年度の研究費の使用計画

本年度のイネの発芽過程におけるオートファジーの役割の解析では、芽生えの形態学的観察に先立ち、種子タンパク質の消長についての生化学解析を中心に行った。そのため形態解析に必要なマイクロスライサーやその他関連物品の購入を見送った。生化学解析に必要な物品はすでに研究室に備わっていた。以上から実支出が当初見込みよりも少なくなった。
次年度は、芽生えの形態学的観察に必要なマイクロスライサーやその他関連物品を購入予定であり、本年度の未使用額をこれにあてる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Roles of autophagy in chloroplast recycling (2014)
  • 著者名/発表者名: Ishida, H., Izumi M., Wada, S., Makino A
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg. 巻: 1837 ページ: 512-521
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2013.11.009
  • 査読あり
• [雑誌論文] OsATG7 is required for autophagy-dependent lipid metabolism in rice postmeiotic anther development (2014)
  • 著者名/発表者名: Kurusu, T., Koyano, T., Hanamata, S., Kubo, T., Noguchi, Y., Yagi, C., Nagata, N., Yamamoto, T., Ohnishi., T, Okazaki, Y., Kitahata, N., Ando, D., Ishikawa, M., Wada, S., Miyao, A., Hirochika, H., Shimada, H., Makino, A., Saito, K., Ishida, H., Kinoshita, T., Kurata, N., Kuchitsu, K.
  • 雑誌名: Autophagy 巻: 10 ページ: 1-11
  • DOI: 10.4161/auto.28279
  • 査読あり
• [雑誌論文] Deficiency of autophagy leads to significant changes of metabolic profiles in Arabidopsis (2013)
  • 著者名/発表者名: Izumi, M., Hiema, J., Ishida, H.
  • 雑誌名: Plant Signal Behav. 巻: 8 ページ: -
  • DOI: 10.4161/psb.25023
  • 査読あり
• [学会発表] 植物の栄養リサイクルと葉緑体のオートファジー (2014)
  • 著者名/発表者名: 石田宏幸
  • 学会等名: 日本農芸化学会シンポジウム
  • 発表場所: 生田（明治大学）
  • 年月日: 20140328-20140330
  • 招待講演
• [学会発表] Autophagy for Photodamaged Chloroplast in Arabidopsis (2014)
  • 著者名/発表者名: Izumi，M., Ishida，H., Makino，A., Hidema, J.
  • 学会等名: 日本植物生理学会
  • 発表場所: 富山（富山大学）
  • 年月日: 20140318-20140320
• [学会発表] オートファジーの欠損がイネの栄養成長と窒素転流へ与える影響の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 林田泰和、和田慎也、来須孝光、朽津和幸、牧野周、石田宏幸
  • 学会等名: 日本植物生理学会
  • 発表場所: 富山（富山大学）
  • 年月日: 20140318-20140320
• [学会発表] Role of autophagy in Rubisco degradation during leaf senescence (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishida, H., Ono, Y., Wada, S., Izumi, M., Yoshimoto, K., Mae, T., Makino, A.
  • 学会等名: 6th European Workshop on Leaf Senescence
  • 発表場所: フランス（INRA-Versailles）
  • 年月日: 20131014-20131018
• [学会発表] Identification of a rice autophagy defected mutant, OsATG7, and phenotypes in the life cycle (2013)
  • 著者名/発表者名: Wada, S., Hatyashida, Y., Kurusu, T., Kuchitsu, K., Makino, A., Ishida, H.
  • 学会等名: 6th European Workshop on Leaf Senescence
  • 発表場所: フランス（INRA-Versailles）
  • 年月日: 20131014-20131018
• [学会発表] Autophagy in plant energy availability (2013)
  • 著者名/発表者名: Izumi, M., Hirota, T., Hidema, J., Makino, A.
  • 学会等名: 6th European Workshop on Leaf Senescence
  • 発表場所: フランス（INRA-Versailles）
  • 年月日: 20131014-20131018
• [学会発表] イネオートファジー欠損変異体Osatg7 の生理解析－ ( その１) 栄養成長期における個体生育について－ (2013)
  • 著者名/発表者名: 和田慎也、林田泰和、来須孝光、朽津和幸、牧野周、石田宏幸
  • 学会等名: 日本土壌肥料学会
  • 発表場所: 名古屋（名古屋大学）
  • 年月日: 20130911-20130913
• [学会発表] イネオートファジー欠損変異体Osatg7 の生理解析－（その２）葉の老化過程における窒素転流への影響について－ (2013)
  • 著者名/発表者名: 林田泰和、和田慎也、来須孝光、朽津和幸、牧野周、石田宏幸
  • 学会等名: 日本土壌肥料学会
  • 発表場所: 名古屋（名古屋大学）
  • 年月日: 20130911-20130913
• [学会発表] イネにおけるRubisco-containing body/ オートファジー系の可視化 (2013)
  • 著者名/発表者名: 泉正範、日手間純、近藤依里、牧野周、石田宏幸
  • 学会等名: 日本土壌肥料学会
  • 発表場所: 名古屋（名古屋大学）
  • 年月日: 20130911-20130913