研究課題
微生物をコロニーとして分離する純粋培養法は微生物学の基本で、実験的にも細胞の生死はコロニー形成能で定義されてきた。しかし近年、環境中の大半の細菌がコロニー形成できないことが認識されるようになった。明らかにコロニー形成は、生きている以上の特別な現象だが、その違いを我々は知らず、旧来のコロニー分離法は細菌の膨大な多様性資源を得る障壁となっている。本研究では、コロニー形成能を失った大腸菌変異株を取得して解析し、さらに低温飢餓でコロニー形成能が失われていくのを相補する遺伝子を得て、コロニー形成に重要な遺伝子の働きを解明することをめざす。(1) 大腸菌のコロニー形成不全変異：液体培養を基準にして、高温で寒天培地上にコロニーを形成せず液体培地で増殖できるfabB温度感受性変異体を得た。FabBは脂肪酸合成の鍵酵素である。そこでオレイン酸存在下で、野生株からfabB欠損株を構築した。これを用い培地の影響を詳細に検討し、微量のオレイン酸存在下で液体培養では増殖できるが固体培養では増殖できない条件を見出した。微量のオレイン酸で液体／固体培養の挙動に違いが出ることは野生株でも定性的に観察された。(2) 大腸菌のコロニー形成能保持に重要な遺伝子：大腸菌を低温飢餓に曝すと分裂能を保ちつつコロニーを作れないVBNC状態に陥り、自然の細菌がコロニー形成能を失うモデルとされる。VBNC化はコロニー形成に必要な遺伝子機能が減衰する過程だと考え、遺伝子発現強化により低温飢餓に曝してもVBNC状態に陥りにくくなる遺伝子を複数見出した。(3) コロニー形成に関与する遺伝子候補として、電子伝達系複合体IVを規定するcydB、及びappC遺伝子の欠損株が、親株と異なり液体培養に比して有意にコロニー形成能の低いことを見いだし、コロニー形成にとって好気呼吸が何らかの重要性をもつことが示唆された（分担者）。
2: おおむね順調に進展している
１． 大腸菌のコロニー形成能を失った変異の分離は大変困難な計画であったが、液体培養を基準にしてコロニー形成を捉え、温度感受性変異ライブラリーから目標に近い株の分離に成功したことは基本的成果。次いで、野生株を元にfabB欠失株を作製したことで、培地成分と生育特性の関係を正確に分析できたるようになった。さらに、環境中の細菌に注目する場合、変異株でなく野生株の挙動が重要だが、変異株の保持に必要な脂肪酸の供給が野生株の生育にも影響を及ぼすという発見は、成果の広がりを予測させる。２． 当初、コロニー欠損変異の原因として、固体培養には必須だが液体培養に不要な遺伝子を期待したが、得られたのは独立栄養に必須な脂肪酸合成の遺伝子であった。また培地には最も一般的なL-brothを用いたが、これに微量の脂肪酸が含まれるため脂肪酸供給を制限した培養となり、fabB変異株の液体培養と固体培養とで脂肪酸の利用性と生育挙動に大きな差異が出る、という発見となった。実験計画は基本的に満たしているが、脂肪酸供給がなぜ液体培養と固体培養の挙動に差を生じるかという仕組み解明と、これが環境微生物学の挙動をどこまで説明できるかが今後の課題である。３． 大腸菌のコロニー形成能保持に重要な遺伝子のスクリーニングは、本研究期間中に開始から実現まで可能となった成果である。４． 研究代表者の行った以上のスクリーニング系実験と、結果は現時点で交差していないが、研究分担者が別の経緯により検討を行った、電子伝達系関連遺伝子の欠損により，液体増殖に比してコロニー形成能が低下する知見は従前にない新規な成果である。以上のように当初の予想・計画を超えた成果が一部に出つつあると言えるが、いずれも、論文としての成果発表がこれからという意味で、総合的に達成度は「おおむね順調に進展」と判断した。
1. コロニー不全大腸菌変異株の研究：自然の細菌の大半がコロニーを作れない問題を、液体培養と固体培養での増殖頻度の違いの問題に置き換えることで，初めてコロニー形成不全変異の議論が進んだ。①自然の細菌は変異体ではないので、野生型大腸菌でも液体培養と固体培養で差が生じる性質を追求する。また、②fabB変異体において、脂肪酸添加の効果が固体培養で増幅される現象の生化学的機構の解明、③脂肪酸制限下の液体培養で脂肪酸欠乏になったあと急激にコロニー形成能が低下する現象の解明、④固化剤の固体培養への影響の解明、をまとめる方向で研究を進める。2. 大腸菌のコロニー形成能保持に重要な遺伝子のスクリーニングは、当初の期待以上に候補がみつかってきた。ただし、それらの遺伝子機能は多様で、①それぞれがコロニー形成保持方向に作用する生化学的機構の解明を進める。②複数の遺伝子発現を組み合わせて、コロニー形成能保持の傾向が強化されるかどうかを調べる。（以上、研究代表者）3. 自然の難培養細菌におけるコロニー形成過程の研究：以上の大腸菌を用いた研究で得られた知見が、自然の細菌のコロニー形成でも働いているかどうかを検討し、自然の多様な細菌の分離培養法における旧来のコロニー分離法の問題点を踏まえて、改良法を考案する。とくに、分離培地への脂肪酸の添加効果、および、コロニー形成能を高く保つ遺伝子レベルを上げた大腸菌株の育種と、自然細菌の分離への応用可能性を探る。(研究分担者)4. 以上の成果の論文による公表を急ぐ。
おもに、平成25年度内に予定していたメタボローム解析や，多数の自然分離株のゲノムシークエンシングなどの実施が、次年度に廻ったため。脂肪酸合成酵素欠損株とビタミン合成系の欠損株が、なぜ液体培養に比して固体培地上のコロニー形成能が損なわれるか、メタボローム解析を行う。また、自然サンプルから、液体培地で増殖できて固体培地で増殖できない株を複数分離し、これらからコロニーを作るようになった変異株を分離して、ゲノムシークエンシングで変異点を求め、コロニー形成と遺伝子との対応関係を調べる。
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PLoS ONE
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High Pres. Res.
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