| 研究課題/領域番号 |
24380052
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
高橋 俊二 独立行政法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, ユニットリーダー (30311608)
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| 研究分担者 |
奥村 英夫 公益財団法人高輝度光科学研究センター, その他部局等, 研究員 (90377903)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 生合成 / スピロアセタール / アルキルマロニルCoA / リベロマイシン / 放線菌 / ポリケチド |
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| 研究実績の概要 |
I. スピロアセタール形成機構の解明：RevG、RevJの結晶化条件検討を継続して行った。本年度は、安定化条件を向上させるための精製条件をさらに検討した結果、均一に精製されたRevG, RevJの収率を改善することが出来た。得られた酵素を用いてさらに異なる結晶化条件を検討した。また、反応機構を詳細に解析するために数種の合成トリオール化合物を基質として反応を解析し、基質特異性に関する知見を得た。
II. 新規エステル化酵素反応の解明：同一転写ユニットを形成し、遺伝子破壊実験によりエステル化反応への関与が示唆されているRevK, L, Mを精製し複合酵素反応を検討した。また、タンパク質を混合後に各組み合わせでゲル濾過を行ったところ、予想に反し多量体形成を示唆する結果は得られなかった。次に、RevL反応産物の検討を行った。中間反応産物の同定は困難であった為、生成する二リン酸を定量するMESG法を用いて、RevLの基質特異性を再評価した。
III. アルキルマロニルCoA生合成機構の解明：RevRを精製し生化学的に解析を行った結果、脂肪酸生合成の初期反応に関わる酵素であることが示唆された。一方、反応検出系の構築が困難であるため、反応動力学的な解析は今後の課題である。また、精製RevSと脂肪酸基質の反応解析により、本酵素が様々な遊離の中鎖脂肪酸をアシルCoA体に変換できることを見出しているが、本年度はさACPを用いた変換反応、還元カルボキシル化酵素(RevT)を用いたカップリング反応を検討した。これまでの遺伝子破壊実験に加えて、生化学解析からリベロマイシン類の構造多様化に関わるアルキル側鎖生合成にはRevR, RevS, RevTが重要な機能を担うことを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ジヒドロキシケトン合成酵素(RevG)、スピロアセタール合成酵素(RevJ)及びポリケチド合成酵素ドメインのアシル基転移酵素(PKS-AT4)の結晶構造解析条件を検討したが、詳細な解析につながる良好な結晶を得ることが出来なかった。タンパク質結晶化に要する時間は予測が困難であり、結果的に研究遅延が生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請課題のうち、進展が遅れているジヒドロキシケトン合成酵素(RevG)、スピロアセタール合成酵素(RevJ)及びポリケチド合成酵素ドメインのアシル基転移酵素(PKS-AT4)の結晶構造解析条件を集中的に検討し、結晶解析を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ジヒドロキシケトン合成酵素(RevG)、スピロアセタール合成酵素(RevJ)及びポリケチド合成酵素ドメインのアシル基転移酵素(PKS-AT4)の結晶構造解析条件を検討したが、詳細な解析につながる良好な結晶を得ることが出来なかった。タンパク質結晶化に要する時間は予測が困難であり、結果的に研究遅延による未使用の研究経費が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記理由により、タンパク質の精製、結晶化条件検討、結晶解析とシンポジウムでの研究成果発表を次年度に行う事とし、未使用額はその経費に充てることにしたい。
物品費 (800,000 円), 旅費 (80,000 円), 人件費謝金 (250,000 円), その他 (39,668 円)
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