| 研究実績の概要 |
I. スピロアセタール形成機構の解明：RevG、RevJ結晶化条件の検討を継続して行った。酵素の安定性を向上させるためにいくつかの精製条件を検討し、RevG, RevJ収率をさらに改善することが出来た。得られた酵素を用いて結晶条件を検討した。
II. 新規エステル化酵素反応の解明：同一転写ユニットを形成し、遺伝子破壊実験により反応への関与が示唆されているRevK, L, Mをそれぞれ精製し複合酵素反応を検討した。各酵素は非常に不安定であることから、精製手法を確立することが重要であった。そこで、本年度は高活性の酵素を取得するために、精製条件の検討を行った。
III. アルキルマロニルCoA生合成機構の解明：RevRを精製しその反応を検討した結果、脂肪酸生合成の初期反応に関わる酵素であることが示唆されているが、反応検出系の構築が困難であるため、反応動力学的な解析は今後の課題である。また、精製RevSを用いて、脂肪酸基質、CoA、及びACPとの反応性をさらに詳細に解析した。その結果、RevSはアミノ酸配列からACP-ligaseと予想されたが、様々な遊離の中鎖脂肪酸をアシルCoA体に変換できるCoA-ligaseであり、ACP-ligaseではないことを明らかにした。還元カルボキシル化酵素(RevT)を用いて生化学的に基質特異性を検討したところ、アシルCoAのみを基質にすることを確認した。これまでの遺伝子破壊実験に加えて、生化学解析からリベロマイシン類の構造多様化に関わるアルキル側鎖生合成にはRevS, RevTが重要な機能を担うことを明らかにした。
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