| 研究課題/領域番号 |
24380054
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
三上 文三 京都大学, 農学研究科, 教授 (40135611)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | X線結晶構造解析 / タンパク質工学 / タンパク質構造変化 / 酵素反応 / 食品関連酵素 |
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| 研究概要 |
タンパク質の機能の多くは分子中の可動ループの構造変化によって発現されるが、その構造変化を捉えることは困難な場合が多い。可動ループの構造変化を研究する手段としてはX線結晶構造解析が有効であるが、その場合でも可動ループが結晶中で自由に動ける結晶を調製する必要がある。本研究では食糧関連酵素としてβ-アミラーゼ、アルギン酸リアーゼ、プロテイングルタミナーゼおよびトランスグルタミナーゼを取り上げ、3年間でこれらの酵素の可動ループの構造と機能を徹底的に解明し、それぞれの酵素の可動ループのタンパク質工学を可能にし、これらの酵素の機能解析と新機能酵素の設計に役立てることを目的としている。これらの酵素は食品産業において現在用いられているか、これから用いられる酵素であり、本研究の成果は直ちに応用研究に役立つものである。β-アミラーゼについては、活性部位に存在する3か所の可動部位(Gly96からAsn104までのフレキシブルループ、Asn340からGlu345までのインナーループ、Lys295の側鎖の構造変化)について、各部位の変異体を用いて、結晶中で基質アナログのマルトース濃度を変化させた時のマルトースの結合と各可動部位の動きを調べて、構造変化のマルトース濃度依存性から、フレキシブルループとインナーループおよびLys295の側鎖の構造変化がどのような順番で酵素反応を進めているのかを明らかにした。アルギン酸リアーゼについては基質の取り込みと生成物の遊離に重要なリッドループの解析を行った。プロテイングルタミナーゼについては、プロ領域に存在する活性阻害ループの改変を利用して、触媒反応の共有結合中間体の構造をX線結晶構造解析によって明らかにした。一方、トランスグルタミナーゼについては、プロ型酵素の構造から、プロ領域が活性クレフトを覆い、酵素活性を阻害していることが明らかにされているので、このプロ領域ペプチドを合成し、成熟酵素との相互作用を検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
β-アミラーゼについては、平成24年度に多数の変異体の解析を行うことができた。プロテイングルタミナーゼについては、結晶中での共有結合中間体の形成条件を明らかにすることができた。また、トランスグルタミナーゼについては、N末端プロ領域ペプチドを合成し、成熟酵素との相互作用を研究する見通しができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
β-アミラーゼ、アルギン酸リアーゼ、プロテイングルタミナーゼおよびトランスグルタミナーゼの中で、アルギン酸リアーゼの解析は、ほぼ終了した。今後は、β-アミラーゼの変異体を用いた更なる解析とプロテイングルタミナーゼの反応機構の解析、およびトランスグルタミナーゼとそのプロ領域ペプチドとの相互作用についての解析に重点を置いて研究を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本研究は平成24年度より3年間の計画により行うものであり、平成25年度に必要な経費を確保するために一部繰越している。平成25年度はタンパク質精製の機材(液体クロマトグラフィー用ポンプ)の購入等を行い、タンパク質の発現と精製、結晶化およびX線結晶構造解析の更なる効率化を図る予定である。
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