食品関連酵素の可動ループ機能の解明

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24380054
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 三上 文三 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (40135611)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: タンパク質工学 / 酵素工学 / タンパク質結晶構造解析 / 構造生物学

研究実績の概要

タンパク質の機能の多くは分子中の可動ループの構造変化によって発現されるが、その構造変化を捉えることは困難な場合が多い。可動ループが結晶中で自由に動ける結晶を調製してX線結晶構造解析を行うのが有力な方法である。本研究では実際に食品産業において用いられているβ‐アミラーゼ、アルギン酸リアーゼ、プロテイングルタミナーゼおよびトランスグルタミナーゼを取り上げ、これらの酵素の可動ループの構造と機能を徹底的に解明することを目的とした。
１．β‐アミラーゼの可動ループの解析　β-アミラーゼの活性部位に存在する二つの可動ループ上の変異体を作成し、基質アナログであるマルトースの濃度変化に対応する各ループの構造変化を捉えることに成功している。その詳細を明らかにするために野生型、T342S、 T342A、V99A、V99I等の変異体の結晶化をい、1.3 Å以上の分解能での構造解析を行った。また、ループおよび基質結合のpH変化については、凍結状態では実験の再現性が得られないため、野生型酵素の非凍結状態（キャピラリー封入）の結晶を用いて大型放射光施設で一連の予備的測定を行った。
２．トランスグルタミナーゼのプロ領域ペプチドの役割　トランスグルタミナーゼとそのプロ領域ペプチドの複合体のX線結晶構造解析を行い、複合体はプロ酵素と同様の構造をとることを明らかにした。また、このペプチドは酵素反応の阻害剤として作用することを明らかにした。
３．プロテイングルタミナーゼの活性部位の解析　プロテイングルタミナーゼのプロ体の変異体を用いて調製したSアシル中間体の構造解析から本酵素の反応機構を検討した結果、本酵素はアンモニアイオンの存在で逆反応が可能なことが推定された。そこで、触媒ポケット周辺の残基の変異により、タンパク質のグルタミン酸残基をグルタミン残基に変換する酵素の設計を行った。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

26年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Preliminary X-ray analysis of the binding domain of the soybean vacuolar sorting receptor complexed with a sorting determinant of a seed storage protein. (2015)
  • 著者名/発表者名: Maruyama, N., Goshi, T., Sugiyama, S., Niiyama, M., Adachi, H., Takano, K., Murakami, S., Inoue, T., Mori, Y., Matsumura, H., Mikami, B.
  • 雑誌名: Acta Crystallogr. F Struct. Biol. Commun. 巻: 71 ページ: 132-135
  • DOI: 10.1107/S2053230X14027484
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Metabolic fate of unsaturated glucuronic/iduronic acids from glycosaminoglycans: molecular identification and structure determination of streptococcal isomerase and dehydrogenase. (2015)
  • 著者名/発表者名: Maruyama Y., Oiki S., Takase R., Mikami B., Murata K., Hashimoto, W.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 290 ページ: 6281-6292
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.604546
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Crystal structure of 5-formyl-3-hydroxy-2-methylpyridine 4-carboxylic acid 5-dehydrogenase, an NAD⁺-dependent dismutase from Mesorhizobium loti. (2015)
  • 著者名/発表者名: Mugo, A.N,. Kobayashi, J., Mikami, B., Yoshikane, Y., Yagi, T., Ohnishi, K.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 456 ページ: 35-40
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.11.028
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structure-based conversion of the coenzyme requirement of a short-chain dehydrogenase/reductase involved in bacterial alginate metabolism. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takase, R., Mikami, B., Kawai, S., Murata, K., Hashimoto, W.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 289 ページ: 33198-33214
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.585661
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Crystal structure of class III chitinase from pomegranate provides the insight into its metal storage capacity. (2015)
  • 著者名/発表者名: Masuda, T., Zhao, G., Mikami, B..
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem. 巻: 79 ページ: 45-50
  • DOI: 10.1080/09168451
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Atomic structure of recombinant thaumatin II reveals flexible conformations in two residues critical for sweetness and three consecutive glycine residues. (2014)
  • 著者名/発表者名: Masuda, T., Mikami, B., Tani, F.
  • 雑誌名: Biochimie. 巻: 106 ページ: 33-38
  • DOI: 10.1016/j.biochi.2014.07.016
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The crystal structure of a crustacean prophenoloxidase provides a clue to understanding the functionality of the type 3 copper proteins. (2014)
  • 著者名/発表者名: Masuda, T., Momoji, K., Hirata, T., Mikami, B.
  • 雑誌名: FEBS J. 巻: 281 ページ: 2659-2673
  • DOI: 10.1111/febs.12812
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structure of 4-pyridoxolactonase from Mesorhizobium loti. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi, J., Yoshikane, Y., Yagi, T., Baba, S., Mizutani, K., Takahashi, N., Mikami, B.
  • 雑誌名: Acta Crystallogr. F Struct. Biol. Commun. 巻: 70 ページ: 424-432
  • DOI: 10.1107/S2053230X14003926
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] β-アミラーゼ／マルトース不幸剛体結晶構造のpH変化 (2015)
  • 著者名/発表者名: 三上文三、河村和広、安達基泰、水谷公彦、高橋延行
  • 学会等名: 日本農芸化学会2015年度大会
  • 発表場所: 岡山大学
  • 年月日: 2015-03-28
• [学会発表] 麹菌Aspergillus oryzae由来グルコアミラーゼのX線構造解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 永吉恵美、水谷公彦、高橋延行、三上文三、瀧井幸男
  • 学会等名: 日本農芸化学会2015年度大会
  • 発表場所: 岡山大学
  • 年月日: 2015-03-28
• [学会発表] 甘味タンパク質ソーマチンの連続フェムト秒結晶構造解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 桝田哲哉、南後恵理子、菅原道泰、鈴木守、登野健介、城地保昌、亀島敬、PARK Jaehyun、SongChangyong、初井宇記、矢橋牧名、大久保喬平、三上文三、北畠直文、谷史人、岩田想
  • 学会等名: 日本農芸化学会2015年度大会
  • 発表場所: 岡山大学
  • 年月日: 2015-03-28
• [学会発表] 連鎖球菌による哺乳類細胞外マトリクス（グルコサミノグリカン）の分解：不飽和グルクニルヒドロラーゼの反応機構 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中道優介、老木紗予子、三上文三、村田幸作、橋本渉
  • 学会等名: 日本農芸化学会2015年度大会
  • 発表場所: 岡山大学
  • 年月日: 2015-03-28
• [学会発表] イネにおけるジベレリン代謝酵素の構造と機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 竹原清日、三上文三、樫尾徹、松岡信、上口美弥子
  • 学会等名: 日本農芸化学会2015年度大会
  • 発表場所: 岡山大学
  • 年月日: 2015-03-27
• [学会発表] 市街吸収分光法とX線結晶構造解析によるリジル‐tRNA合成酵素とL‐リジンの結合の解析およびその融合適合機構に対する洞察 (2015)
  • 著者名/発表者名: 滝田禎亮、三上文三、井上國世
  • 学会等名: 日本農芸化学会2015年度大会
  • 発表場所: 岡山大学
  • 年月日: 2015-03-27
• [学会発表] ダイズβ-アミラーゼのSer297及びIl299変異体の酵素化学的性質と結晶構造 (2014)
  • 著者名/発表者名: 河村和広、水谷公彦、高橋延行、三上文三
  • 学会等名: 2014年度日本農芸化学会関西支部大会（第486回講演会）
  • 発表場所: ・奈良先端科学技術大学院大学
  • 年月日: 2014-09-20
• [学会発表] Structure and Function Analysis of Geobacillus Starch Antistaling Enzyme (SAS) (2014)
  • 著者名/発表者名: Bunzo Mikami, Hirotaka Bitoh, Yurie Anzai, Kimihiko Mizutani, Nobuyuki Takahashi, Masamichi Okada, Shotaro, Yamaguchi
  • 学会等名: 23rd Congress and General Assembly of the International Union of Crystallography
  • 発表場所: Montreal, Canada
  • 年月日: 2014-08-05 – 2014-08-12
• [備考] 応用構造生物学分野
  • URL: http://www.structure.kais.kyoto-u.ac.jp/
• [備考] 京都大学農学研究科応用生命科学専攻応用構造生物学分野
  • URL: http://www.applife.kais.kyoto-u.ac.jp/system/fck/11.pdf